姜愛文，陳禹均，董 超，張增凱，劉紅林，吳望軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

miR-206是一種骨骼肌特異性miRNA，它的表達具有骨骼肌組織特異性以及分化時序性[1-2]。它通過與下游靶基因形成沉默復(fù)合體(RISC)，調(diào)控靶基因mRNA或蛋白水平，從而影響各個生命活動，如細胞增殖、細胞分化以及細胞凋亡[3-5]。RAO等[6]和KOUTALIANOS等[7]的研究發(fā)現(xiàn)miR-206是肌分化標(biāo)志基因MyOD和MyOG的下游，對骨骼肌分化起正向調(diào)節(jié)作用。隨著研究的深入，其下游靶基因被廣泛驗證，如CDK4、cyclingD1、connexin43等都是它的靶基因，且它能通過下調(diào)這些基因的表達使細胞周期發(fā)生阻滯、影響肌細胞分化[1,8-9]。除此之外，miR-206可以通過調(diào)控Smad3、TGF-teta1、HDAC4等基因的表達促進骨骼肌修復(fù)，加速成肌形成[10]，這對骨骼肌相關(guān)疾病的治療具有極大的意義。

骨骼肌纖維根據(jù)其結(jié)構(gòu)、代謝和收縮特點的不同被分成快肌纖維和慢肌纖維兩大類[11-12]。其中，由于慢肌當(dāng)中富含氧氣、線粒體和肌紅蛋白，代謝過程以氧化還原反應(yīng)占主導(dǎo)地位，因此顏色比快肌深，呈紅色，而快肌纖維則以無氧代謝為主，顏色呈白色[12]。研究表明，miR-206除了參與骨骼肌細胞的分化過程，也可調(diào)控骨骼肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化的過程。Lee等人發(fā)現(xiàn)miR-206的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)會影響不同肌纖維類型在骨骼肌中的占比[13]，WILLIAMS等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-206在慢肌中表達量極顯著高于快肌，暗示miR-206參與調(diào)節(jié)肌纖維類型的轉(zhuǎn)換。能量代謝的變化，是肌纖維類型轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)。為了研究miR-206能否通過調(diào)控能量代謝過程影響肌纖維類型的轉(zhuǎn)化，本試驗通過生物信息學(xué)軟件Targetscan(Release 3.1)篩選到了與能量代謝密切相關(guān)的、miR-206新的下游靶基因—G6PD，通過雙熒光素酶報告基因載體確定兩者的靶標(biāo)關(guān)系，并研究miR-206及G6PD在不同骨骼肌纖維中的表達模式，為進一步分析miR-206調(diào)控骨骼肌纖維提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物以48頭二元商品豬杜洛克×梅山為研究群體，選取肌纖維類型肉色差異極顯著的個體3頭(31,36,39)，利用其組織及骨骼肌樣品進行定量分析。以279頭四元商品豬皮特蘭×杜洛克×長白×大白為研究群體，根據(jù)本實驗室前期工作[15]，選取肌內(nèi)脂肪含量極高或極低的個體各8頭，進行定量分析。宰前禁食24 h，自由飲水。所有處理均符合南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物管理協(xié)會處理辦法。

1.2 RNA提取與qRT-PCR測定總RNA的提取按Trizol試劑盒說明書進行。使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(638313，TaKaRa，大連，中國)對miR-206進行反轉(zhuǎn)錄，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A，TaKaRa)對G6PD mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green 熒光實時定量PCR(RR820A，TaKaRa)檢測miR-206及G6PD的相對表達量。miR-206的表達以miR-17為內(nèi)參，mRNA的表達以HPRT為內(nèi)參。引物均由金唯智生物科技有限公司(蘇州，江蘇，中國)合成，相關(guān)序列參見表1。

表1 相關(guān)引物序列

1.3 細胞培養(yǎng)雙熒光素酶報告基因載體的轉(zhuǎn)染使用293T細胞，293T細胞接種于T25中，用含有10%胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，St.Louis,MO,USA)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone Laboratories，Logan,UT,USA)進行生長培養(yǎng)。所有細胞放于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞經(jīng)胰酶37℃消化處理2 min后，立即加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min后棄上清，收集細胞沉淀。

1.4 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染使用LipofectamineTM3000試劑(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)，將miR-206過表達質(zhì)粒(PSP-206)及其陰性對照(PSP-U1)，脂質(zhì)體分別使用按照六孔板每孔125 μL Optin培養(yǎng)基稀釋，將稀釋好的脂質(zhì)體與質(zhì)?；旌虾箪o置5 min后轉(zhuǎn)染細胞，具體操作按說明書進行。

1.5 雙熒光素酶分析5種PmirGLO雙熒光素酶報告基因載體由捷瑞公司(上海，中國)合成，內(nèi)含豬G6PD基因野生型或突變型3′非翻譯區(qū) (3′UTR) 的300個堿基對。結(jié)合位點的序列由ACATTCC突變?yōu)锳TAATGC。 其中，G6PD-M1為突變miR-206與G6PD的第1個結(jié)合位點，G6PD-M2為突變miR-206與G6PD的第2個結(jié)合位點，G6PD-M3為突變miR-206與G6PD的第3個結(jié)合位點，G6PD-M4是將miR-206與G6PD的3個結(jié)合位點全部突變。293T細胞接種到24孔板中，轉(zhuǎn)染后48小時使用雙熒光素酶分析試劑盒(Promega，Madison,WI,USA)進行熒光測定。

2 結(jié)果

2.1 miR-206候選靶基因預(yù)測使用DNAMAN8.0對不同物種miR-206的序列進行比對，結(jié)果表明，miR-206在人、小鼠與豬等3個物種間序列非常保守，3個物種miR-206成熟序列主要來源于前體序列的3′端，在3個物種的成熟體序列中，人與小鼠的完全一致，豬與人、小鼠的序列僅最后1個堿基存在差異(圖1A)。通過Targetscan對miR-206的新靶基因進行預(yù)測，并選擇與miR-206種子序列至少有7個堿基的結(jié)合，且結(jié)合處序列在人、小鼠與豬等3個物種間完全保守的基因作為候選靶基因，最終確定了6個基因作為miR-206調(diào)控肌纖維形成的關(guān)鍵候選靶基因，包括FNDC3B基因、G6PD基因、Notch3基因、PDCD4基因、Smyd4基因與TNPO2基因。

由于不同類型肌纖維的主要差異在于其能量代謝方式的不同[12]，在該6個候選靶基因中，只有G6PD與能量代謝密切相關(guān)，因此我們接下來分析了miR-206與G6PD的結(jié)合特點，結(jié)果顯示miR-206種子序列與豬G6PD在3′UTR區(qū)存在3個結(jié)合位點(圖1B)。其次，利用RNAHybrid軟件對miR-206與G6PD結(jié)合的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進行了預(yù)測，最小自由能(mfe)分析結(jié)果顯示，miR-206與G6PD的3′UTR結(jié)合形成二聚體后最小自由能的絕對值大于83.736×103J/mol(圖1C)。

圖1 miR-206候選靶基因預(yù)測 A.人、豬及小鼠中miR-206前體及成熟序列對比分析；B.豬中miR-206與G6PD位點結(jié)合分析；C.豬miR-206與G6PD結(jié)合后最小自由能分析

圖2 G6PD是miR-206的靶基因 1.A為豬野生型及突變型G6PD雙熒光酶報告基因載體構(gòu)建圖；2.B為miR-206與G6PD雙熒光素酶驗證分析；3.字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 miR-206靶向G6PD為驗證miR-206是否參與調(diào)控G6PD，以及miR-206與G6PD間3個結(jié)合位點是否具有調(diào)控效果，在構(gòu)建野生型G6PD雙熒光素酶報告基因載體的同時，構(gòu)建3個結(jié)合位點依次突變的突變型載體MUT1、MUT2和MUT3，以及3個位點全部突變的突變型載體MUT4(圖2A)，將 miR-206過表達載體與野生型、突變型G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后檢測293T細胞內(nèi)雙熒光素酶活性，結(jié)果如圖2B所示，與對照組相比(PSP-U1)，miR-206過表達質(zhì)粒和野生型G6PD共轉(zhuǎn)染進293T細胞后顯著降低了G6PD載體的雙熒光素酶活性(P<0.05)，即miR-206下調(diào)G6PD的表達；與miR-206和野生型G6PD質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染相比，miR-206與G6PD的M1、M2及M4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后顯著地提高了G6PD雙熒光酶報告基因載體的熒光活性(P<0.05)，但miR-206與G6PD的M3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后G6PD雙熒光酶報告基因載體的熒光活性無顯著差異(P>0.05)，即突變了第1、第2以及全部結(jié)合位點后，miR-206對G6PD表達的抑制效果減弱，但突變第3個結(jié)合位點后miR-206對G6PD表達的抑制效果未發(fā)生顯著變化，這說明miR-206通過前2個結(jié)合位點調(diào)控G6PD的表達，兩者的第3個結(jié)合位點屬于無效位點。

2.3 miR-206在豬的不同組織和肌肉中表達模式分析檢測miR-206在豬的不同組織中表達水平，結(jié)果顯示miR-206在豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃及脂肪組織中均不表達，而只在背最長肌中特異性表達(圖3A)。分離豬的不同肌纖維類型的骨骼肌，包括2種慢肌肌肉—咬肌、比目魚肌，以及2種快肌肌肉—背最長肌和股二頭肌，并利用qRT-PCR檢測快慢肌纖維標(biāo)志基因MyHC-1，MyHC-2b及Myob的表達水平，結(jié)果顯示在以慢肌纖維為主的咬肌和比目魚肌中，慢肌纖維標(biāo)志基因MyHC-1和Myob的表達水平普遍高于以快肌纖維為主的背最長肌和股二頭肌，而快肌纖維標(biāo)志基因MyHC-2b的表達水平則普遍低于以快肌纖維為主的背最長肌和股二頭肌(圖2B～D)，以上結(jié)果表明，咬肌和比目魚肌是典型的慢肌，背最長肌和股二頭肌則為快肌。

通過對以上4種肌肉中miR-206表達水平的檢測，結(jié)果顯示miR-206在咬肌中的表達水平極顯著高于其在背最長肌和股二頭肌中的表達量(P<0.01)，在比目魚肌中的表達水平顯著高于其在背最長肌和股二頭肌中的表達水平(P<0.05)(圖3E)，即miR-206在慢肌中的表達水平顯著高于快肌。

圖3 豬miR-206不同組織及骨骼肌中表達模式分析 1.A為miR-206在豬的不同組織中的表達模式；2.B～D為MyHC-1，MyHC-2b及Myob在不同肌纖維類型肌肉中的表達鑒定;3.E為miR-206在不同肌纖維類型肌肉中的表達模式;4.*表示與咬肌相比存在顯著差異(P<0.05)，**表示與咬肌相比存在極顯著差異(P< 0.01)，#表示與比目魚肌相比存在顯著差異

2.4 G6PD在豬的不同組織和肌肉中表達模式分析qRT-PCR檢測G6PD在豬的不同組織及骨骼肌中的表達模式，結(jié)果顯示G6PD在豬脂肪組織中表達量普遍高于其在其他組織中的表達量，除心臟外，在背最長肌中表達最低，但其在咬肌和比目魚肌中的表達量與其在背最長肌和股二頭肌中的表達量無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

圖4 豬G6PD不同組織及骨骼肌中表達模式分析 A.G6PD在豬不同組織中的表達模式；B.G6PD在豬不同骨骼肌中的表達模式

2.5 miR-206和G6PD在高低組肌內(nèi)脂肪中表達模式分析鑒于G6PD在脂肪組織中的高表達，且BONNET等[16]的研究表明G6PD與肌內(nèi)脂肪含量密切相關(guān)，因此我們使用qRT-PCR檢測miR-206和G6PD在豬高、低組肌內(nèi)脂肪中的表達模式，結(jié)果顯示miR-206在高組、低組肌內(nèi)脂肪中的表達水平無顯著差異(P>0.05)，而G6PD在肌內(nèi)脂肪含量高的樣品中表達水平略高于肌內(nèi)脂肪含量低的樣品，但也未到達顯著差異(P>0.05)(圖5)。

圖5 miR-206和G6PD在高低組肌內(nèi)脂肪中表達水平 A.miR-206在高低組肌內(nèi)脂肪中的表達水平；B.G6PD在高低組肌內(nèi)脂肪中的表達水平

3 討論

楊飛云等[17]的研究表明,慢肌纖維含量高的肌肉瘦肉率高、脂肪沉積少、肉質(zhì)肥美，而快肌纖維和慢肌纖維的不同除體現(xiàn)在顏色、收縮特點外，還有能量代謝的差異，慢肌主要進行有氧呼吸，而快肌主要進行無氧呼吸。G6PD是磷酸戊糖途徑(PPP)中的第1個關(guān)鍵酶，它能催化6-磷酸葡萄糖(glucose hexaphosphate)脫氫，形成6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphogluconic acid,6PG)。因此，在miR-206預(yù)測的6個靶基因中，我們選擇G6PD作為miR-206的候選靶基因，并使用肉色差異最明顯的3頭個體豬，檢測G6PD在不同類型肌肉中的表達水平。

mfe分析方法在許多miRNA驗證靶基因的過程中被使用，是輔助驗證靶基因的方法之一，通常認為，最小自由能的絕對值越高，則結(jié)合越穩(wěn)定。miRNA與靶基因結(jié)合后形成的二聚體結(jié)構(gòu)，其mfe的絕對值大于83.736×103J/mol時，該靶基因才能用于后續(xù)分析。我們發(fā)現(xiàn)miR-206與G6PD的mfe為-103.833 J/mol，說明兩者之間結(jié)合穩(wěn)定，G6PD可作為miR-206的候選靶基因進行研究。miR-206的轉(zhuǎn)染可顯著降低野生型G6PD的熒光活性，這說明miR-206能下調(diào)G6PD的表達，但與野生型G6PD相比，第1、第2個結(jié)合位點的突變能顯著提高G6PD報告基因載體的熒光活性，而只有第3個結(jié)合位點突變后不能改變G6PD的熒光活性，因此，miR-206可以通過前2個結(jié)合位點調(diào)控G6PD的表達，而第3位點則不起調(diào)控作用。miR-206在骨骼肌組織中特異表達，而G6PD在骨骼肌組織中表達量處于較低水平，兩者相反的表達模式進一步證明了G6PD是miR-206的靶基因。

通過對快慢肌纖維標(biāo)志基因的檢測，我們確定咬肌和比目魚肌是慢肌，背最長肌和股二頭肌是快肌，即使用以上4種肌肉對快慢肌纖維的差異基因進行檢測是可靠的。盡管在豬的骨骼肌中，miR-206可以調(diào)控G6PD，且miR-206的表達量在快肌和慢肌中也存在顯著差異，但G6PD的表達在快慢肌中卻無顯著差異，這說明G6PD不是miR-206調(diào)控肌纖維類型的候選基因。研究發(fā)現(xiàn),G6PD與不同品種豬的大理石花紋有關(guān)，且我們的試驗結(jié)果也表明G6PD在脂肪組織中表達最高，為進一步研究在豬骨骼肌中miR-206調(diào)控G6PD所引起的生物學(xué)效應(yīng)，我們檢測了高肌內(nèi)脂肪含量組和低肌內(nèi)脂肪含量組中miR-206與G6PD的表達水平，結(jié)果表明miR-206與G6PD在高低組肌內(nèi)脂肪中均無顯著差異，即miR-206和G6PD與豬骨骼肌中肌內(nèi)脂肪含量的高低無關(guān)，因此G6PD在骨骼肌中的功能，以及miR-206調(diào)控骨骼肌纖維的靶基因仍需進一步研究。

miR-206在不同物種間高度保守，且在骨骼肌組織中特異表達。G6PD是miR-206的靶基因，盡管miR-206通過前2個結(jié)合位點下調(diào)G6PD表達，但G6PD不能影響肌纖維類型的轉(zhuǎn)化和脂肪沉積。