李 晗，李艷芹，李仲林，陳良柱，方炳虎,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642 ；2.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東 云浮 527300)

阿莫西林(amoxicillin，AMO)是一種半合成青霉素類抗生素，獸醫(yī)臨床主要用于尿道、呼吸道、皮膚感染等疾病的治療。阿莫西林屬于時(shí)間依賴性藥物，但因其在動(dòng)物體內(nèi)半衰期短，其在臨床應(yīng)用中需要多次給藥。肉雞內(nèi)服給藥15 mg/kg劑量阿莫西林[1]，其消除半衰期為1.8 h，Tmax為0.47 h，Cmax為2.29 mg/L。為減少青霉素類藥物在臨床使用中的給藥次數(shù)，開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效緩釋的青霉素類藥物成為了新型青霉素藥物的研究熱點(diǎn)。

丙磺舒(probenecid，PB)又名羧苯磺胺,是苯甲酸的一種衍生物。丙磺舒在體內(nèi)主要通過(guò)腎近曲小管的主動(dòng)分泌來(lái)排泄，又因其脂溶性大，容易被再吸收，故其在體內(nèi)排泄緩慢。研究表明[2-5]，丙磺舒與青霉素類藥物聯(lián)合使用能抑制青霉素類藥物在腎小管的排泄，延長(zhǎng)青霉素藥物的半衰期及其體內(nèi)作用時(shí)間。丙磺舒還會(huì)抑制阿莫西林在肝臟和腎臟中的分布[6]。

藥物拼合是將2種藥物或它們的衍生物通過(guò)化學(xué)鍵合的方式形成具有多結(jié)合靶點(diǎn)或多重作用機(jī)制的藥物。藥物拼合的方式包括2種：一種是將具有不同作用機(jī)制的抗菌藥物通過(guò)化學(xué)鍵連接，藥物在體內(nèi)被特定酶水解再釋放出原化合物而發(fā)揮雙重抗菌作用(dual-action)[7]；一種是將具有不同作用靶點(diǎn)的藥物通過(guò)化學(xué)鍵連接，這種鍵合方式不會(huì)被體內(nèi)酶水解，形成的新的雜合分子或雜合藥物可作為整體與病原的不同靶標(biāo)結(jié)合發(fā)揮其多靶點(diǎn)抗菌作用[8]。被拼合的不同藥物在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)上的差異還可改善其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及降低毒副作用等[7,9]。藥物拼合原理的出現(xiàn)大大縮短了新藥研發(fā)的速度。課題組參考舒他西林[10-11]的合成路線，將丙磺舒和阿莫西林以亞甲基橋連接形成雙酯結(jié)構(gòu)，成功合成出一種新型阿莫西林-丙磺舒拼合物(amoxicillin-probenecid twin drug，命名為AB)，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證及含量檢測(cè)。拼合物相對(duì)分子質(zhì)量為663.21，為淡黃色固體粉末，易溶于甲醇，微溶于水。

對(duì)拼合物進(jìn)行的的體外模擬代謝試驗(yàn)表明，其能在小腸酯酶的作用下完全分解成阿莫西林和丙磺舒。本試驗(yàn)以阿莫西林、阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥為對(duì)照，研究阿莫西林-丙磺舒拼合物在小鼠體內(nèi)的比較藥代動(dòng)力學(xué)，為阿莫西林-丙磺舒拼合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑阿莫西林(先秦藥業(yè)，含量為99.6%)；丙磺舒(北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)，含量98.0%)；阿莫西林-丙磺舒拼合物(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理教研室合成，經(jīng)前期研究結(jié)構(gòu)確證與含量分析，含量為93.19%)；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純(美國(guó)Thermo Fisher公司)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、正己烷均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)；試驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)提供。

1.2 主要儀器超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)，配有Agilent 1290型液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)、AB Triple QuadTM 4500型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex公司)及Analyst 1.6.3軟件(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。MS 3 basic型多功能振蕩器，德國(guó) IKA 公司。Thermo Multifuge X1R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

1.3.1阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱取阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)品20.08 mg，用超純水溶解，定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為 2 g/L的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于4℃冰箱保存。

1.3.2拼合物溶液 精密稱取拼合物71.90 mg，以色譜甲醇溶解，定容至20 mL，得到質(zhì)量濃度為3.35 g/L 的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠(合格證號(hào)SYXK(粵)2018-0087)，體質(zhì)量18～22 g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)前禁食12 h，正常供應(yīng)飲水。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1液相條件 色譜柱：Luna C18(2)100A(150 mm×2 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速為300 μL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為5 μL，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 阿莫西林梯度洗脫程序

1.5.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)阿莫西林進(jìn)行定量分析。電噴霧電壓(IS)為 5 500 V，離子源溫度(TEM)為 500℃，霧化氣壓力(GS1)為 60 Pa，輔助氣流速(GS2)為 60 L/min，氣簾氣壓力(CUR)為 30 Pa，碰撞室壓力為(CAD)6 Pa。MRM參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 阿莫西林及丙磺舒的質(zhì)譜參數(shù)

注：*代表定量離子

1.6 樣品前處理方法取100 μL小鼠血漿樣品，加入200 μL色譜乙腈，渦旋1 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清 150 μL加入 350 μL純水稀釋，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.7 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限、定量限 采用空白基質(zhì)添加法。取空白小鼠血漿按照1.6的方法處理，將阿莫西林儲(chǔ)備液稀釋，添加至空白基質(zhì)中，稀釋為1,2,5,10,20,50,100,200,500 μg/L的樣品，上機(jī)檢測(cè)，以藥物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，藥物濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)其進(jìn)行線性回歸分析，求標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)。在此檢測(cè)條件下，信噪比S/N≥3定為檢測(cè)限，信噪比S/N≥10定為定量限。

1.7.2回收率與精密度 將一定質(zhì)量濃度的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加到空白血漿，配制成5，25，500 μg/L 的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)重復(fù)，按照1.6的方法處理后上機(jī)，同時(shí)制備空白基質(zhì)添加樣品，采用單點(diǎn)定量法進(jìn)行分析，求得相對(duì)回收率。

將阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加到空白血漿配制成5，25，500 μg/L的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5個(gè)重復(fù)，連續(xù)做3個(gè)批次，按照1.6的方法處理上機(jī)，計(jì)算日內(nèi)精密度及日間精密度。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)將體質(zhì)量為18～22 g的昆明小鼠隨機(jī)分為3組，每組各72只，將受試樣品及參比試劑分別按照藥物含量換算給藥量，實(shí)際給藥量均為阿莫西林20 mg/kg，給藥方式為灌胃給藥。20 mg/kg劑量的阿莫西林，20 mg/kg+13.60 mg/kg劑量的阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥(A+B，MA∶MB=1∶1)以及33.36 mg/kg劑量的阿莫西林拼合物(AB)。在給藥后0.083 ，0.166，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8 h進(jìn)行小鼠眼球摘除采血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6個(gè)平行。樣品采集完，將離心得到的血漿置于-80℃冰箱保存，待測(cè)。

1.9 數(shù)據(jù)處理將試驗(yàn)得到的血漿樣品按照1.6中的方法處理分析，得到小鼠血漿中的藥物質(zhì)量濃度。采用winNonlin(Version5.2.1) 軟件的非房室模型對(duì)藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.5的檢測(cè)條件下，阿莫西林在譜圖上能夠呈現(xiàn)較好的峰形(圖1)。阿莫西林的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=45.7X+390.41，(R2=0.9983)(圖2)。檢測(cè)限為0.05 μg/L，定量限為1 μg/L。

圖1 基質(zhì)加阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)液液相-質(zhì)譜圖 圖2 阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 回收率與精密度血漿中阿莫西林添加質(zhì)量濃度為5，50,500 μg/L時(shí)，其平均回收率介于85.32%～97.54%之間，批內(nèi)精密度介于2.60%～6.09% 之間，批間精密度介于4.81%～7.25%之間，詳見(jiàn)表3。表明方法具有較好的回收率和精密度，滿足定量分析要求。

表3 阿莫西林小鼠血漿中的回收率與精密度 %

2.3 阿莫西林(AMO)、阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥(A+B)及阿莫西林-丙磺舒拼合物(AB)在小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征按照 20 mg/kg阿莫西林的有效劑量，分別灌胃給藥阿莫西林(AMO)、阿莫西林/丙磺舒(A+B，MA∶MB=1∶1)、以及阿莫西林-丙磺舒拼合物(AB)后，小鼠體內(nèi)阿莫西林的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。用藥動(dòng)學(xué)軟件winNonlin5.2.1的非房室模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，其中，阿莫西林-丙磺舒拼合物較聯(lián)合用藥(阿莫西林/丙磺舒)的相對(duì)生物利用度(以阿莫西林計(jì))為110.35%。具體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

圖3 小鼠灌等劑量阿莫西林(20 mg/kg)下，阿莫西林(AMO)、阿莫西林/丙磺舒(A+B)和拼合物(AB)血漿中阿莫西林的藥物濃度-時(shí)間曲線圖

3 討論

3.1 拼合物與阿莫西林單藥的藥代動(dòng)力學(xué)比較從表3中數(shù)據(jù)看出，該研究中所用阿莫西林-丙磺舒拼合物(AB)的達(dá)峰濃度(以阿莫西林計(jì))較高，與阿莫西林單藥差異顯著(P<0.01)，說(shuō)明拼合物在小鼠體內(nèi)吸收較好；其次拼合物與阿莫西林的消除半衰期(t1 /2ke)分別為(1.77±0.23 )，(1.04±0.21) h，MRTlast分別為(2.64±0.24)，(1.81±0.11) h，均差異顯著(P<0.01)，說(shuō)明拼合物在小鼠體內(nèi)消除更慢，駐留時(shí)間更長(zhǎng)；同時(shí)拼合物的AUClast遠(yuǎn)高于阿莫西林單藥，其生物利用度是阿莫西林的198.09%，表明拼合物AB在小鼠體內(nèi)生物利用度更高。分析原因可能是拼合物在體內(nèi)慢慢分解為阿莫西林和丙磺舒，丙磺舒通過(guò)提高機(jī)體對(duì)阿莫西林的吸收[12]，提高了Cmax和AUClast；同時(shí)，丙磺舒對(duì)阿莫西林在腎小管分泌過(guò)程中存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制[12-13]，導(dǎo)致分解出的阿莫西林在小鼠體內(nèi)消除緩慢，t1 /2ke和MRTlast顯著延長(zhǎng)。

表4 小鼠灌服等劑量阿莫西林(20 mg/kg)下，阿莫西林單藥(AMO)、阿莫西林/丙磺舒(A+B)和拼合物(AB)血漿中阿莫西林的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：*a，**a表示拼合物與阿莫西林的藥代動(dòng)力參數(shù)比較的t檢驗(yàn)結(jié)果； *b，**b表示拼合物與阿莫西林/丙磺舒的藥動(dòng)參數(shù)比較的t檢驗(yàn)結(jié)果，P<0.01差異極顯著(**)，0.010.05 差異不顯著；F表示拼合物的相對(duì)生物利用度

3.2 拼合物與阿莫西林/丙磺舒聯(lián)用藥(A+B)的藥代動(dòng)力學(xué)比較由表3可知，拼合物(AB)在小鼠體內(nèi)的(按阿莫西林計(jì))消除半衰期t1 /2ke為(1.77±0.23) h，AUClast為(11.41±0.75) mg·h/L，比阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥(A+B)的t1 /2ke(1.49±0.50) h、AUClast(10.34±0.94 )mg·h/L 顯著增加(0.010.05)，相對(duì)生物利用度(F)為110.35%，表明阿莫西林/丙磺舒形成拼合物后，對(duì)阿莫西林的影響較大，拼合技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用使其達(dá)峰時(shí)間增加，消除半衰期延長(zhǎng)，生物利用度更高。分析其原因可能是因?yàn)槠春衔锏碾p酯結(jié)構(gòu)使得其親脂性增加，能夠增加藥物的細(xì)胞膜通透性[14-15]，而且羧酸酯酶在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，其對(duì)酯鍵有很好的水解作用[16]，本試驗(yàn)中的阿莫西林-丙磺舒拼合物在羧酸酯酶作用下部分水解成單藥，產(chǎn)生緩慢釋放的效果，同時(shí)分解出的丙磺舒也在腎小管產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，延緩了阿莫西林的消除，提高了阿莫西林的生物利用度。

本試驗(yàn)對(duì)比了阿莫西林林-丙磺舒拼合物、阿莫西林及阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了阿莫西林-丙磺舒拼合物在體內(nèi)可以在酯酶作用下水解成丙磺舒和阿莫西林而共同發(fā)揮藥效，可充分發(fā)揮丙磺舒對(duì)阿莫西林的增效作用，顯著增加阿莫西林的生物利用度，延長(zhǎng)阿莫西林在體內(nèi)的作用時(shí)間，且與聯(lián)合用藥相比更加長(zhǎng)效。這為阿莫西林-丙磺舒拼合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)新型青霉素類藥物提供了新的思路。