李佳瑞，楊雨齊，李思鴻，程 平，肖天石，于泓瀟，張藝馨，劉芮萌，李富磊，張秀英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

大腸桿菌是存在于人和動物腸道中的主要共棲菌和條件性致病菌，也是引起腸道感染的主要原因之一[1-2]?？咕幬锸侵委煷竽c桿菌感染的主要藥物，但是由于抗菌藥物的不合理使用和濫用，導(dǎo)致大腸桿菌對多種抗菌藥物的敏感性逐漸下降，出現(xiàn)了多重耐藥及泛耐藥大腸埃希菌。多重耐藥(multi-drug resistance,MDR)是指細(xì)菌對3類或3類以上不同抗菌藥物耐藥，泛耐藥是指細(xì)菌對臨床上幾乎所有的抗菌藥物耐藥。多重耐藥及泛耐藥菌株的出現(xiàn)為臨床治療帶來了新難題，其中外排泵系統(tǒng)在細(xì)菌多重耐藥的形成中發(fā)揮著重要的作用。AcrAB-TolC主動外排系統(tǒng)是大腸桿菌產(chǎn)生多重耐藥性的重要機制之一，它能夠介導(dǎo)藥物的外排，阻止抗菌藥物在菌體內(nèi)的集聚[3]，使細(xì)菌耐藥。據(jù)報道，當(dāng)AcrAB-TolC主動外排系統(tǒng)基因過表達(dá)時，大腸桿菌對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物的耐藥性隨之增強，而一旦敲除了該系統(tǒng)中acrA、acrB或tolC基因，則會提高菌株對抗菌藥物的敏感性。

外排系統(tǒng)的表達(dá)受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)[4-6]，主要包括AcrR、MppA、MarA、SoxS、RobA、FIS、RamA及RpoS等。根據(jù)調(diào)節(jié)的作用不同，可將調(diào)控因子分為正向調(diào)控因子和負(fù)向調(diào)控因子2類，正向調(diào)控因子可以促進(jìn)AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的表達(dá)，如MarA、SoxS、RobA等，負(fù)向調(diào)控因子可以抑制AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的表達(dá)(如AcrR)。

本試驗擬通過擴增多重耐藥大腸桿菌細(xì)菌膜融合蛋白AcrA及外排轉(zhuǎn)運蛋白AcrB編碼基因(TolC為多種外排泵共同的外膜通道蛋白，對AcrAB-TolC外排泵不具備特異性)，探索豬源多重耐藥大腸桿菌中AcrAB-TolC主動外排基因表達(dá)量與其多重耐藥性的相關(guān)性,并測定其主動外排調(diào)控基因marA、soxS、robA、acrR的相對表達(dá)量，目的是為大腸桿菌多重耐藥性的防控以及臨床合理使用抗菌藥物提供理論依據(jù)，也為大腸桿菌多重耐藥機制的進(jìn)一步研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株藥敏質(zhì)控菌株大腸桿菌(ATCC25922)購自中國獸藥監(jiān)察所；臨床分離大腸桿菌菌株分離自我國部分省市規(guī)?；B(yǎng)豬場，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室分離鑒定并保存。

1.2 藥品與試劑及主要儀器MH營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、酵母粉、蛋白胨、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、MHA瓊脂培養(yǎng)基，均購自哈爾濱百潔斯生物科技公司；藥敏紙片磺胺甲基異惡唑(SMZ)、氟苯尼考(FLO)、多西環(huán)素(DOX)、慶大霉素(GEN)、頭孢氨芐(CEX)、恩諾沙星(ENR)、阿奇霉素(AZM)、阿莫西林(AMC)、新霉素(NEO)、阿米卡星(AMK)、卡那霉素(KAN)均購自杭州微生物試劑有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol均購自美國Sigma公司。超潔凈工作臺(型號為J3012)，購自上海博迅實業(yè)股份有限公司；熒光定量PCR儀，購自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；PCR擴增儀(型號為JY3000)，購自德國Biometra公司；恒溫培養(yǎng)搖床(型號為THZ-300)，購自江蘇吉特實驗儀器廠；高壓滅菌鍋(型號為TOMYSX500)，購自北京儀和方園科技有限公司。

1.3 藥敏試驗參照世界衛(wèi)生組織(WHO)所建議的Kirby-Bauer法來進(jìn)行藥敏試驗。將待測菌株以三區(qū)劃線的方式接種于MH瓊脂培養(yǎng)基上，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，然后將菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷岫?1×108CFU/mL)。蘸取少量待測菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)平板上，用無菌棉簽將菌液均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基表面。涂好后放置3～5 min，用鑷子將藥敏紙片貼于MH瓊脂培養(yǎng)基上，倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，使用游標(biāo)卡尺測量培養(yǎng)皿內(nèi)的抑菌圈的直徑。豬源大腸桿菌的藥物敏感性根據(jù)CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)來判定(表1)[7-8]。

表1 藥敏試驗判定的標(biāo)準(zhǔn)

1.3 PCR檢測多重耐藥大腸桿菌臨床分離株中acrA、acrB、tolC基因

1.3.1模板的制備 將試驗菌株三區(qū)劃線接種于MH瓊脂，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，用接種環(huán)挑取單一菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)5～6 h。取1.5 mL的增菌液于EP管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清。加入300 μL滅菌ddH2O，用渦旋儀震蕩使其懸起，100℃水浴煮沸15 min，迅速冰浴10 min，12 000 r/min離心3 min，制得的上清即為DNA模板；

1.3.2引物設(shè)計 參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計acrA、acrB基因引物序列，tolC基因參照NC_000913自行設(shè)計，引物由上海生工有限公司合成(表2)。

表2 acrA acrB tolB基因引物序列

1.3.3PCR擴增 反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL(100 ng),PCR Mixture 10.0 μL,(10 μmol/L)F、R 引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s,acrA為62℃、acrB為60℃、tolC為58℃退火30 s,72℃ 延伸90 s,72℃終延伸10 min。

1.4 多重耐藥大腸桿菌臨床分離株主動外排基因相對表達(dá)量的測定將上述檢測出共表達(dá)3種主動外排基因的多重耐藥菌株分為2組，設(shè)置以耐8～10種抗菌藥物菌株作為高耐藥譜組(7株)，以耐3～5種抗菌藥物的菌株作為低耐藥譜組(5株)，并以質(zhì)控菌株ATCC25922作為對照組。試驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法定量計算分析各基因表達(dá)量，分析主動外排基因acrA、acrB的相對表達(dá)量與大腸桿菌多重耐藥的相關(guān)性。反應(yīng)體系見表3。

表3 主動外排基因相對表達(dá)PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；兩步法95℃ 變性15 s,58℃，30 s；融解為95℃，10 s；65℃，60 s；97℃，1 s；冷卻為37℃，30 s。

1.5 多重耐藥大腸桿菌菌株主動外排基因調(diào)控因子相對表達(dá)量的測定采用RT-PCR方法檢測上述高、低耐藥譜組多重耐藥菌株AcrAB-TolC主動外排調(diào)控因子的mRNA表達(dá)量。引物序列見表4。具體方法同1.4。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果25株豬源大腸桿菌對11種臨床常見抗菌藥物的耐藥情況見表5，25株豬源致病性大腸桿菌對11種抗菌藥物的耐藥率見圖1；25株豬源致病性大腸桿菌對11種抗菌藥物多重耐藥數(shù)見圖2；表明25株豬源大腸桿菌對11種臨床常見抗菌藥物產(chǎn)生較為嚴(yán)重的耐藥。且大多為多重耐藥菌株。

2.2 PCR擴增結(jié)果PCR擴增結(jié)果見圖3～5。acrA、acrB和tolC等3種基因在25株豬源大腸桿菌臨床分離株總的攜帶率分別為68.00%，72.00%和76.00%。

表4 marA robA soxS基因引物序列

表5 25株豬源大腸桿菌的耐藥表型

圖1 25株豬源大腸桿菌對11種抗菌藥的耐藥率 (SMZ、FLO、DOX、GEN、CEX、ENR、AZM、AMC、NEO、AMK、KAN分別代表：磺胺甲基異惡唑、氟苯尼考、多西環(huán)素、慶大霉素、頭孢氨芐、恩諾沙星、阿奇霉素、阿莫西林、新霉素、阿米卡星、卡那霉素)

圖2 25株豬源大腸桿菌對11種抗菌藥物多重耐藥數(shù)

2.3 豬源大腸桿菌主動外排基因相對表達(dá)量與多重耐藥性的相關(guān)性不同耐藥數(shù)量豬源大腸桿菌株acrA和acrB基因相對表達(dá)差異見表6。從結(jié)果可以看出，菌株的耐藥數(shù)量和acrA和/或acrB基因相對表達(dá)量的多少呈正相關(guān)，耐藥數(shù)量多的菌株，其acrA和/或acrB基因的相對表達(dá)量亦高。

2.4 豬源大腸桿菌主動外排調(diào)控基因表達(dá)量與多重耐藥性的相關(guān)性不同耐藥數(shù)量菌株marA，soxS，robA和acrR基因的相對表達(dá)差異見表7。結(jié)果表明，菌株的耐藥數(shù)量和調(diào)控基因marA，soxS

圖3 部分acrA基因凝膠電泳圖

圖4 部分acrB基因凝膠電泳圖

圖5 部分tolC基因凝膠電泳圖

表6 12株不同耐藥數(shù)量細(xì)菌acrA和acrB基因的mRNA表達(dá)量

表7 不同耐藥數(shù)量豬源大腸桿菌主動外排調(diào)控基因的相對表達(dá)量

的相對表達(dá)量呈正相關(guān)；與調(diào)控基因acrR的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；對于調(diào)控基因robA來說，所有臨床分離株該基因的表達(dá)量都低于大腸桿菌ATCC25922的表達(dá)量，且與耐藥數(shù)量無明顯相關(guān)性。

3 討論

本試驗通過藥敏紙片法檢測了25株豬源安普霉素耐藥大腸桿菌對11種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果顯示，25株豬源致病性大腸桿菌對11種抗菌藥物均表現(xiàn)較高的耐藥性，多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。25株豬源致病性大腸桿菌對臨床常用抗菌藥物磺胺甲基異惡唑耐藥率達(dá)到了80%；對阿莫西林，新霉素和氟苯尼考的耐藥率超過了60%；對頭孢氨芐、卡那霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星和慶大霉素耐藥率超過了40%；對阿奇霉素和阿米卡星耐藥率也較高，分析原因可能與人們?nèi)狈ο嚓P(guān)的耐藥性知識，臨床不合理用藥以及將抗菌藥物作為飼料添加劑有關(guān)。

AcrAB-TolC外排泵是導(dǎo)致大腸桿菌多重耐藥的主要原因之一，與大腸桿菌的多重耐藥有明顯相關(guān)性，2011年劉建華等[10]人采用熒光定量PCR方法對鴨源大腸桿菌外排泵基因AcrAB-TolC進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明外排泵基因的表達(dá)量與多重耐藥菌株耐藥數(shù)量成正相關(guān)[8]。朱曉華等[11]在對鮑曼不動桿菌外排泵基因adeA的研究中，發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株adeA基因的相對表達(dá)量均高于敏感菌株。本試驗也證實了acrA、acrB等2種主動外排基因與多重耐藥菌株的耐藥數(shù)量具有相關(guān)性。本試驗采用熒光定量PCR檢測方法，測定并比較了不同耐藥譜的多重耐藥豬源大腸桿菌主動外排基因acrA和acrBmRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢測的2種主動外排基因中，高耐藥譜中除了菌株H8的acrA、acrB相對表達(dá)量低于低耐藥譜組外，其余菌株的acrA、acrB相對表達(dá)量均較高；低耐藥譜中除了菌株H9的acrA、acrB相對表達(dá)量高于高耐藥譜組外，其余菌株的acrA、acrB相對表達(dá)量均低于高耐藥譜菌株的表達(dá)水平。分析原因可能與菌株間存在個別差異性，或菌株H8與H9存在其他主動外排系統(tǒng)有關(guān)。以上結(jié)果表明，acrA、acrB2種外排基因表達(dá)量和多重耐藥的耐藥數(shù)量正相關(guān)。

主動外排系統(tǒng)是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的主要原因之一，外排系統(tǒng)的表達(dá)水平受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，例如AcrR，MarA，MppA，RobA和SoxS等，其中正向調(diào)節(jié)因子包括MarA，SoxS和RobA，負(fù)向調(diào)控因子包括AcrR，它們可以用來調(diào)控大腸桿菌多種基因的轉(zhuǎn)錄[12]，進(jìn)而改變大腸桿菌對不同藥物的敏感性，導(dǎo)致耐藥率增多。本試驗中我們選取耐不同數(shù)量的多重耐藥菌株，檢測豬源大腸桿菌marA，soxS，robA以及acrR調(diào)控基因的表達(dá)水平，分析調(diào)控基因表達(dá)水平與耐藥性的關(guān)系，為探究多重耐藥的基地奠定了一定的基礎(chǔ)。結(jié)果表明，結(jié)果顯示，在12株多重耐藥菌株中，除了菌株H4的marA基因的表達(dá)量略低于標(biāo)準(zhǔn)菌株外，其余菌株marA、soxS的表達(dá)量均高于標(biāo)準(zhǔn)菌株的表達(dá)量，且耐藥數(shù)量多的菌株，其基因的相對表達(dá)量也比較高；多重耐藥大腸桿菌的耐藥譜數(shù)與調(diào)控基因acrR的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；調(diào)控基因robA的相對表達(dá)量均低于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其表達(dá)量的高低和耐藥譜數(shù)無明顯相關(guān)性。