胡辯紅，韓萍萍，唐宇杰，崔萍萍，韓兆玉，李惠俠

(南京農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，江蘇 南京 210095)

奶牛乳腺組織的健康與養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益和乳品質(zhì)有著直接關系。盡管廣泛實施控制措施，奶牛乳房炎仍然是一個棘手的問題。乳房炎的發(fā)生通常伴隨著促炎性細胞因子的分泌，但是炎性因子的過量產(chǎn)生，特別是 IL-1β 和 TNF-α 的過度分泌，會促使一系列繼發(fā)性炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生并導致局部/全身病理學疾病[1]。活性氧(ROS)作為一種促炎性介質(zhì)，是導致各種炎癥性疾病繼發(fā)性的關鍵原因。當其積累超出機體的抗氧化能力時，會對宿主細胞和吞噬細胞本身造成損害，主要通過降低細胞外基質(zhì)與乳腺上皮細胞的黏附性，引起乳腺上皮細胞死亡、脫落及泌乳功能的損傷[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是對細胞內(nèi)外應激具有處置應答能力的另一亞細胞行為，也是細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量未折疊或錯誤折疊蛋白積累的一種適應性應答方式。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是炎癥的有效組成部分，不僅參與炎癥反應，同時也是引起炎癥的重要原因[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激同時也可促進Ca2+釋放激活多種激酶參與自噬信號轉(zhuǎn)導[4]。自噬是細胞內(nèi)一種依賴溶酶體的降解途徑，可發(fā)揮改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用[5]。越來越多的證據(jù)表明自噬與各種生理病理狀況有關。自噬異常激活將會導致過度的自我消化和細胞死亡，成為致病機制之一[6]。因此自噬成為疾病研究的新靶標。

Chemerin也稱為視黃酸受體反應蛋白2(RARRES2)，是2007年新確認的脂肪因子，在白色脂肪組織和肝臟中高度表達?，F(xiàn)已證實，Chemerin在脂肪脂解與分化、糖代謝、生殖調(diào)控、腫瘤等方面都發(fā)揮一定的調(diào)控作用[7]。而在免疫功能方面，許多試驗證據(jù)支持Chemerin/ CMKLR1的促炎作用，但也有研究表明該信號傳導途徑具有抗炎功能[8]，這主要取決于Chemerin的酶切位點。Chemerin在奶牛乳腺中表達也被證實，并上調(diào)與脂肪酸合成、葡萄糖攝取和酪蛋白合成相關的基因[9]。但是，關于Chemerin對奶牛乳腺炎和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及自噬的研究目前還比較少。本試驗擬通過Chemerin處理奶牛乳腺上皮細胞以分析炎癥反應，及這個過程當中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與自噬的變化，為探究炎癥與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及自噬之間的關系奠定基礎，進一步完善乳腺疾病的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑重組小鼠蛋白Chemerin(2325-CM-025)購自R&D公司并參考文獻[10]所描述的方法溶解；IL-6(GB11117)購自北京索萊寶生物公司；IL-1β(A1112)購自ABclonal公司；LC3B (NB100-2220SS) 購自 NOVUS生物公司；Bax(50599-2-1g)、Bcl-2(12789-1-AP)、p62/SQSTM1 (18420-1-AP)、GRP78(11587-1-AP)和GAPDH(10494-1-AP)均購自Proteintech公司；Caspase-3(bs-0081R)抗體購自Bioss公司；CHOP(2895)抗體購自Cell Signaling Technology公司；Cytokeratin 18(ab52459)購自Abcam公司；熒光二抗Goat Anti-Rabbit IgG(FMS-Rbaf64701)購自福麥斯生物公司；Hoechst33342染色液(KGA212-50)購自凱基生物公司；ROS檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)與凍存本試驗所采用的奶牛乳腺上皮細胞系哈佛大學孫友平博士所贈送。將處于對數(shù)生長期且融合率達到90%的細胞用PBS沖洗后消化，待大部分細胞變圓且有少部分從培養(yǎng)瓶上脫落懸浮時，加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化，充分晃勻后3 000 r/min離心4 min，去上層液并加入DMSO配制的凍存液，分裝封口后4℃ 30 min→-20℃ 2 h→-80℃ 過夜，最后在液氮中長期保存。從液氮罐中取出凍存的奶牛乳腺上皮細胞并迅速置于37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速融化并轉(zhuǎn)移到超凈臺中，加入提前預熱的完全培養(yǎng)基離心洗滌(3 000 r/min，4 min)2次，重懸后接種在T25培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2、100% 濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。12 h待細胞完全貼壁后輕輕更換培養(yǎng)基以去除死細胞，當細胞生長匯合至90%時進行消化傳代培養(yǎng)，在此期間，每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 試驗設計和處理為了分析Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及自噬的影響，用重組蛋白Chemerin(0.1 mg/L)體外處理細胞24 h，分為對照組和Chemerin組，處理結(jié)束后分別收集細胞并進行相應指標的檢測。試驗濃度和時間的選擇主要依據(jù)于我們團隊先前的研究，證實0.1 mg/L Chemerin處理24 h具有最低的細胞毒性(數(shù)據(jù)未列出)。

1.4 Western blot分析按照試驗方案收集各處理組細胞，每瓶細胞加400 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min后提取細胞總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度并加入上樣緩沖液高溫變性。通過12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品，并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上以形成蛋白印跡，然后將膜與5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗后4℃過夜，徹底洗滌后，在室溫下與HRP偶聯(lián)的二抗孵育1 h，TBST洗3次(10 min/次)，最后用ECL顯影液避光顯色拍照，并通過Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進行灰度分析。

1.5 細胞內(nèi)ROS的檢測將各組細胞制成細胞爬片，處理后用提前預熱的PBS輕輕洗滌3次，根據(jù)ROS檢測試劑盒說明書進行如下操作，細胞與10 μmol/L DCFH-DA 在37℃條件下避光孵育1 h，然后用PBS洗滌3次以去除未進入細胞而殘留的DCFH-DA，用Hoechst33342染液對細胞核復染15 min，PBS洗3次/(3 min/次)，最后在共聚焦顯微鏡下隨機選擇5個高倍視野拍攝并用圖像分析軟件計算出綠色熒光強度的平均值。

1.6 免疫熒光檢測將細胞均勻的接種到24孔爬片上，待細胞融合度達到80%時進行相應處理，然后按照免疫熒光步驟進行如下操作，吸出培養(yǎng)基，用PBS徹底洗滌后加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次/(5 min/次)，隨后用5% Triton-x100膜透化20 min，PBS清洗后用5% BSA孵育1 h以封閉非特異性結(jié)合位點，并在4℃條件下分別與按1∶500稀釋的一抗角蛋白18和p62孵育過夜，PBS洗3次/(5 min/次)，然后與熒光二抗(1∶500)在室溫下避光孵育1 h，用PBS清洗后加入Hoechst33342染核15 min，PBS洗3次后用甘油封片，最后在共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)和鑒定細胞角蛋白是屬于中間絲蛋白家族的一員，其中角蛋白18是乳腺上皮細胞骨架的主要組成成分。在本試驗中，使用角蛋白18的免疫熒光染色鑒定奶牛乳腺上皮細胞。 如圖1所示，細胞形態(tài)清晰，界限分明，呈“鋪路石”狀生長。此外，細胞角蛋白18的陽性染色率大于95%，證明我們培養(yǎng)的細胞中奶牛乳腺上皮細胞占90%以上，可作為細胞模型用于后續(xù)試驗。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)及角蛋白18免疫熒光鑒定細胞(取生長狀態(tài)良好的奶牛乳腺上皮細胞，以1×106 /mL密度接種于24孔板爬片，角蛋白18熒光染色后利用共聚焦顯微鏡觀察，試驗獨立重復3次，每張細胞爬片隨機取5個視野拍攝保存)

2.2 Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞促炎性炎癥的影響將奶牛乳腺上皮細胞與Chemerin孵育24 h后在蛋白質(zhì)水平檢測炎癥相關因子的表達結(jié)果見圖2A，B。與對照組相比， Chemerin組IL-1β和IL-6的蛋白表達顯著升高(P<0.01)；同時，通過免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，ROS的綠色熒光在Chemerin處理后明顯增強(P<0.01)(圖2C，D)，表明Chemerin通過上調(diào)促炎性因子和促炎性介質(zhì)的表達誘發(fā)奶牛乳腺上皮細胞的炎癥反應。

2.3 Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響內(nèi)外環(huán)境中的多種刺激都會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白積聚導致應激反應。為進一步分析Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞的作用，本試驗采用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志基因CHOP的蛋白表達，結(jié)果見圖3A，B。Chemerin的處理使GRP78和CHOP的蛋白表達顯著升高(P<0.05)，證實Chemerin在奶牛乳腺上皮細胞中激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。

2.4 Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞自噬的影響由圖4A，B可知，Chemerin處理顯著增加LC3-Ⅱ并降低p62的蛋白表達(P<0.01)；進一步通過免疫熒光染色觀察到p62表達明顯減弱(P<0.001)(圖4C，D)。這些結(jié)果表明，在奶牛乳腺上皮細胞中Chemerin通過調(diào)控自噬標志基因的表達激活自噬反應。

圖2 Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞細胞炎癥的影響(將奶牛乳腺上皮細胞以1×106 /mL密度接種于6孔板和24孔板爬片中，待細胞融合度達到80%時在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L的Chemerin處理24 h，分為對照組和Chemerin組)1.A為通過蛋白免疫印跡法檢測IL-1β和IL-6的表達； 2.B為通過Image J軟件量化炎癥相關蛋白的水平；3.C為用DCFH-DA染色后，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)ROS表達，每張爬片隨機選取5個視野拍攝，綠色熒光代表ROS，藍色熒光代表細胞核,比例尺：50 μm；4.D為ROS陽性細胞相對于體內(nèi)細胞核總數(shù)的定量分析；5.所有的數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤每個處理一式3份進行；6.與對照組相比，*P< 0.05，**示P<0.01。下同

圖3 Chemerin在奶牛乳腺上皮細胞中對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關鍵蛋白CHOP與GRP78表達的影響(體外調(diào)整奶牛乳腺上皮細胞密度為1×106 /mL并接種于6孔板中，將匯合度達到80%的細胞與0.1 mg/L的重組蛋白Chemerin共同培養(yǎng)24 h，分為對照組和Chemerin組)1.A為通過蛋白免疫印跡法檢測CHOP和GRP78的表達；2.B為通過Image J軟件量化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的水平

圖4 Chemerin對奶牛乳腺上皮細胞自噬的影響(取生長狀態(tài)良好的奶牛乳腺上皮細胞，以1×106 /mL密度接種于6孔板和24孔板爬片中，待細胞融合度達到80%時在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L的Chemerin孵育24 h，分為對照組和Chemerin組)1.A為LC3和p62蛋白表達的電泳圖；2.B為LC3-Ⅱ和p62蛋白的相對表達量；3.C為免疫熒光技術(shù)檢測p62蛋白的表達，每張細胞爬片隨機取5個視野拍攝保存,紅色熒光代表p62蛋白,藍色熒光代表細胞核，比例尺：50 μm；4.D為通過Image J軟件分析p62的平均熒光強度。

3 討論

Chemerin是一種分泌蛋白，病理狀態(tài)下，其大量存在于人體不同的炎性體液和組織中，通過Chemerin/CMKLR1軸實現(xiàn)對炎癥反應的調(diào)節(jié)[11]。本試驗結(jié)果表明，Chemerin及其受體CMKLR1在患有臨床性乳腺炎的奶牛乳腺組織中高表達(數(shù)據(jù)未列出)，與文獻[11]的研究結(jié)果高度一致，提示Chemerin/CMKLR1軸可能參與奶牛乳腺炎的發(fā)生與發(fā)展。

在炎癥或組織損傷部位Chemerin具有募集和激活免疫細胞的特點，其含量升高通常伴隨著炎性因子TNF-a、IL-1β、IL-6 和C反應蛋白的升高[12]。IL-1β在乳腺感染的早期能大量分泌促進免疫細胞活化，發(fā)揮招募聚集第二級細胞因子的能力，并與內(nèi)源性炎癥因子IL-6協(xié)同作用以形成級聯(lián)效應導致組織損傷。乳腺炎發(fā)生過程中TNF-a與IL-1β不僅發(fā)揮促進中性粒細胞遷徙、黏附聚集細胞因子的功能，同時還促進細胞內(nèi)ROS的釋放[13]。在一些炎癥相關的肺部疾病中，活化的炎性細胞被認為積聚在下呼吸道中并釋放大量的ROS，繼而引發(fā)相關疾病的發(fā)展[14]。Chemerin可通過ChemR23依賴性方式刺激ROS產(chǎn)生誘導炎癥[15]。在本試驗中，Chemerin的處理能夠顯著上調(diào)炎性因子IL-1β和IL-6的蛋白表達，同時促進ROS的積累，這表明Chemerin通過促進炎性因子IL-1β和IL-6的分泌以及炎性介質(zhì)ROS的產(chǎn)生參與奶牛乳腺上皮細胞炎癥的發(fā)生發(fā)展。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的多功能細胞器之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失常誘導炎癥反應的能力被認為在疾病發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用。最近的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與促炎因子的激活有關[3]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激能緩解由TNF-α誘導的NF-κB激活，從而抑制炎性細胞黏附因子的上調(diào)[16]。Chemerin在體內(nèi)分泌的減少能抑制氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應[17]。在肥胖誘導的慢性炎癥中，Chemerin水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78呈正相關[18]。GRP78主要負責感應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號，從而調(diào)節(jié)下游的CHOP基因引發(fā)一系列的細胞反應[19]。在本試驗中，Chemerin同樣上調(diào)GRP78和CHOP的蛋白表達激活乳腺上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。近來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是自噬的重要調(diào)控通路。自噬是依賴于溶酶體的降解過程，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要的重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可通過調(diào)節(jié)LC3和ATG5的轉(zhuǎn)錄從而影響自噬體的形成[20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激負調(diào)節(jié)mTOR途徑以增強自噬[4]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致鈣的釋放和隨后AMPK的激活，AMPK抑制ROS從而促進自噬[21]。在奶牛乳腺上皮細胞中我們發(fā)現(xiàn)Chemerin顯著誘導了LC3-Ⅱ蛋白的表達，降低了p62蛋白和免疫熒光的表達。LC3-Ⅱ主要并附著于自噬體膜上，而p62是作為自噬底物存在，高LC-Ⅱ低p62的模式是自噬發(fā)生的黃金指標。因此，Chemerin在奶牛乳腺上皮細胞中可誘導自噬發(fā)生。而自噬又和先天免疫系統(tǒng)相互調(diào)節(jié)，通過消除內(nèi)源性炎性體激動劑以及對與免疫信號傳導相關的介質(zhì)分泌的影響來調(diào)節(jié)炎癥[22]。但異常積累的自噬導致急性炎癥性疾病和細胞死亡[23]。因此，在奶牛乳腺上皮細胞中，Chemerin激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是否介導自噬調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞炎癥，目前尚不明確，還需進一步研究。

綜上所述，細胞因子Chemerin能促進奶牛乳腺上皮細胞炎癥的發(fā)生，同時激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與自噬反應，但具體的機制及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激-自噬反應和炎癥之間的關系還需進一步深入研究，這將為臨床上的靶向奶牛乳腺炎藥物研發(fā)提供部分理論數(shù)據(jù)。