王丙雷，崔亞利*，王 飛，周令強(qiáng)，陳寶江，崔 嘉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000)

動物飼料中的霉菌毒素污染在世界范圍內(nèi)普遍存在，霉菌毒素中毒引起機(jī)體多種功能紊亂，嚴(yán)重?fù)p害動物健康。玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是一種具有類雌激素樣作用的非固醇類真菌毒素，在飼料和飼料原料中檢出率較高，是對動物和人危害較大的主要霉菌毒素之一。眾所周知，ZEA可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和氧化損傷，在體內(nèi)經(jīng)過腸肝循環(huán)后通過腎臟排出體外，故ZEA除具有生殖系統(tǒng)毒性[1]外，還主要表現(xiàn)在肝臟毒性[2-3]和腎臟毒性[4-5]。動物試驗(yàn)已經(jīng)證明，ZEA是一種內(nèi)分泌干擾物，通過影響腦垂體和性腺的功能破壞激素平衡[6]，發(fā)揮雌激素樣作用引起動物生殖功能的損害，而且ZEA對機(jī)體產(chǎn)生的影響與動物生殖狀態(tài)(青春期前、發(fā)情周期 、妊娠期等)、攝入劑量和攝入時間等因素有關(guān)[7]。此外，ZEA通過與細(xì)胞質(zhì)中的雌激素受體結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和一系列細(xì)胞毒性作用，改變血清酶學(xué)和活性氧水平(ROS)。研究表明，ZEA對小鼠的血液、腎臟和肝臟具有高度毒性，可以改變小鼠的酶和血液學(xué)參數(shù)，并且可以誘導(dǎo)更高水平的氧化應(yīng)激[8-9]。

玉米赤霉烯酮由于攝入劑量、靶細(xì)胞類型的不同具有不同的毒性機(jī)制。高劑量ZEA通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激、DNA損傷、線粒體損傷和凋亡引起細(xì)胞死亡[10]。低劑量的ZEA發(fā)揮雌激素樣作用和致癌特性，刺激細(xì)胞的增殖。當(dāng)動物攝入NOAEL (no observable adverse effect level) 劑量ZEA時，并不都表現(xiàn)臨床癥狀但是可引起細(xì)胞和組織水平的機(jī)能障礙。在調(diào)查中，飼料中霉菌毒素濃度通常較低，急性毒性很少發(fā)生，因此研究長期接觸低濃度霉菌毒素對動物和人類健康的影響更具有重要意義。本試驗(yàn)擬在小鼠日糧中添加不同較低劑量的ZEA，研究其對肝臟、腎臟組織結(jié)構(gòu)及血液中代謝產(chǎn)物、抗氧化能力的影響，探討機(jī)體對低劑量ZEA較為敏感的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑ZEA純品由加拿大Triplebond公司生產(chǎn)，純度保證值為98%。

1.2 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理購入體質(zhì)量18～22 g的4周齡SPF級昆明雌性小鼠80只，隨機(jī)分為4組，每組20只。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧(ZEA水平實(shí)測值0.4 mg/kg，GB≤0.5 mg/kg)，試驗(yàn)1、2、3組在基礎(chǔ)日糧中分別添加50，100，150 mg/kg ZEA (ZEA水平實(shí)測值分別48.6，97.4，146.3 mg/kg)，預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期20 d。小鼠自由采食和飲水，每2 d 更換1次墊料。飼養(yǎng)溫度控制在18～22℃，濕度50%～60%。

1.3 添加ZEA日糧的制備按照試驗(yàn)設(shè)計，在小鼠基礎(chǔ)日糧粉狀料中加入相應(yīng)比例ZEA，加水?dāng)嚢?。方法如下：先用無水乙醇溶解(1 g/L)純結(jié)晶狀ZEA，然后噴灑在少量基礎(chǔ)日糧中，處理的飼料室溫過夜使溶劑蒸發(fā)，最后混入基礎(chǔ)料達(dá)到設(shè)計的濃度(mg/kg飼料)。使用塑料漏斗制成柱狀顆粒料，50℃ 5～6 h烘干，采用羅馬公司玉米赤霉烯酮試劑盒檢測日糧ZEA含量。

1.4 樣品采集飼喂20 d后，通過觀察小鼠外陰及陰道涂片，在3 d內(nèi)挑選出發(fā)情前期、發(fā)情期小鼠各10只。對小鼠進(jìn)行眼部采血，靜置2 h，待析出血清后離心，3 500 r/min離心10 min，分離血清-20℃保存，以備測定血清中代謝產(chǎn)物和抗氧化指標(biāo)。采血結(jié)束后頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟、腎臟，波恩液固定，以備制作石蠟切片。

1.5 血清代謝產(chǎn)物測定血清中總蛋白(TP)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和尿素氮(BUN)濃度均采用高密彩虹GF-D2000型半自動生化分析儀測定，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行測定。TP試劑盒(B1010)、CHOL試劑盒(B1002)、TG試劑盒(B1001)、HDL試劑盒(B1003)、LDL試劑盒(B1004)和BUN試劑盒(B1017)均購于北京北檢新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司。

1.6 血清抗氧化指標(biāo)測定血清中總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)活性(含量)均采用高密彩虹722分光光度計測定，按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。T-AOC試劑盒(A015-1)、GSH-Px試劑盒(A005)、SOD試劑盒(A001-1)MDA試劑盒(A003-1)均購于南京建成生物工程研究所。

1.7 石蠟切片的制備波恩液固定的肝、腎組織，常規(guī)制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用由IBM公司推出的SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計與單因素方差分析，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。

2 結(jié)果

2.1 ZEA對小鼠血清代謝產(chǎn)物的影響飼料中添加不同水平ZEA對小鼠血清代謝產(chǎn)物的影響見表1。與對照組相比，發(fā)情前期試驗(yàn)1、2、3組尿素氮的水平極顯著增加(P<0.01)；試驗(yàn)1組總蛋白水平極顯著升高(P<0.01)，試驗(yàn)2 組和3組總蛋白水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)。發(fā)情期小鼠，試驗(yàn)1組與對照組比較尿素氮的水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)，試驗(yàn)2、3組則極顯著升高(P<0.01)；試驗(yàn)1、2、3組總蛋白水平均極顯著升高(P<0.01)。

發(fā)情前期，3個試驗(yàn)組總膽固醇水平與低密度脂蛋白水平極顯著高于對照組(P<0.01)；試驗(yàn)1組和2組高密度脂蛋白水平極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗(yàn)3組的高密度脂蛋白水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)；3個試驗(yàn)組甘油三酯的水平與對照組比較沒有顯著變化(P>0.05)。 發(fā)情期，試驗(yàn)1組總膽固醇水平極顯著高于對照組(P<0.01)，試驗(yàn)2組和3組沒有顯著變化(P>0.05)；3個試驗(yàn)組的高密度脂蛋白水平均極顯著低于對照組(P<0.01)，低密度脂蛋白水平均極顯著高于對照組(P<0.01)；試驗(yàn)1組和2組甘油三酯的水平極顯著升高(P<0.01)，試驗(yàn)3組沒有顯著變化(P>0.05)。

表1 不同添加水平ZEA對小鼠血清代謝產(chǎn)物的影響

注：1.同行數(shù)據(jù)間肩標(biāo)相同或沒有標(biāo)注表示為差異不顯著(P>0.05)；2.肩標(biāo)不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；3.肩標(biāo)不同的大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 ZEA對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響飼料中添加不同水平ZEA對小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響見表2。發(fā)情前期,試驗(yàn)2、3組的總抗氧化能力極顯著低于對照組(P<0.01)，試驗(yàn)1組與對照組比較差異不顯著(P>0.05)；3個試驗(yàn)組的丙二醛水平均極顯著高于對照組(P<0.01)，T-SOD、GSH-Px活性均極顯著低于對照組(P<0.01)。發(fā)情期,試驗(yàn)2、3組的總抗氧化能力極顯著低于對照組(P<0.01)，試驗(yàn)1組與對照組比較差異不顯著(P>0.05)；與對照組比較，試驗(yàn)2、3組的丙二醛水平極顯著升高(P<0.01)，3個試驗(yàn)組T-SOD活性極顯著降低(P<0.01)，試驗(yàn)2、3組的GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，試驗(yàn)1組的GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。

表2 不同添加水平ZEA對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 ZEA對小鼠肝臟、腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響飼料中添加ZEA飼喂小鼠20 d后，對小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響見圖1。發(fā)情前期對照組(圖1A)、試驗(yàn)1組(圖1B)、2組(圖1C)組和3組(圖1D)的肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，試驗(yàn)1組和3組肝細(xì)胞出現(xiàn)了輕微的脂肪變性，試驗(yàn)2組小葉周邊偶見局灶性壞死。在發(fā)情期，試驗(yàn)1組和2組的肝細(xì)胞索均發(fā)生紊亂(圖1F,G)，試驗(yàn)1組(圖1F)肝細(xì)胞脂肪變性，部分肝細(xì)胞核體積增大、深染，雙核肝細(xì)胞數(shù)量增多，近中央靜脈處肝細(xì)胞可見局灶性壞死,小葉周邊肝細(xì)胞壞死；試驗(yàn)2組(圖1G)體積明顯增大且細(xì)胞核深染的肝細(xì)胞數(shù)量增多，肝血竇淤血；試驗(yàn)3組(圖1H)肝細(xì)胞數(shù)量增多，部分細(xì)胞核體積增大。對照組(圖1E)多見雙核肝細(xì)胞。

圖1 ZEA對不同階段各組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響(標(biāo)尺示20 μm,HE染色,粗箭頭示雙倍DNA肝細(xì)胞，細(xì)箭頭示雙核肝細(xì)胞) A～D.分別為發(fā)情前期對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組小鼠肝臟，試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組的肝細(xì)胞出現(xiàn)程度不同的脂肪變性；E～H.分別為發(fā)情期對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組小鼠肝臟，試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組肝細(xì)胞索紊亂，雙核肝細(xì)胞和雙倍DNA肝細(xì)胞增多

2.4 ZEA對小鼠腎組織結(jié)構(gòu)的影響顯微鏡觀察顯示，各試驗(yàn)組腎小體出現(xiàn)不同程度的萎縮，血管球腫脹，充滿腎小囊，腎間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張，充滿血液。試驗(yàn)3組腎小管刷狀緣脫落，腎間質(zhì)毛細(xì)血管顯著擴(kuò)張(圖2)。

3 討論

3.1 ZEA 對血清中代謝產(chǎn)物的影響血清總蛋白(TP) 是血清中所含各種蛋白質(zhì)的總稱，主要由肝臟合成。血清總蛋白含量的變化可以反應(yīng)肝臟的合成功能和腎臟功能障礙時蛋白質(zhì)損失情況。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組TP含量均表現(xiàn)不同程度的升高，尤其是發(fā)情前期試驗(yàn)1組以及發(fā)情期3個試驗(yàn)組總蛋白水平均極顯著升高，結(jié)合本試驗(yàn)肝臟的病理組織學(xué)觀察結(jié)果，隨著ZEA添加劑量的增加，發(fā)情期肝臟中雙核肝細(xì)胞數(shù)量增多，這可能增強(qiáng)肝臟蛋白質(zhì)合成功能，提示本試驗(yàn)劑量的ZEA沒有導(dǎo)致肝臟的蛋白質(zhì)合成功能受損。飼糧中ZEA添加量達(dá)到150 mg/kg時，血清總蛋白水平開始下降。

圖2 ZEA對不同階段的各組小鼠腎結(jié)構(gòu)的影響(標(biāo)尺示20 μm,HE染色,裸箭頭示腎小體，粗箭頭示腎小管) A～D分別為發(fā)情前期對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組小鼠腎臟，試驗(yàn)1組血管球腫脹，充滿腎小囊，試驗(yàn)2組和3組的腎小體萎縮；E～H分別為發(fā)情期對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組小鼠腎臟，試驗(yàn)2組和3組的腎小體萎縮，試驗(yàn)3組腎小管刷狀緣脫落

尿素氮(BUN)是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，腎臟是其排泄的主要器官，腎實(shí)質(zhì)的損傷將增加尿素氮的含量，臨床上常常將BUN作為判斷腎小球?yàn)V過功能的指標(biāo)，是目前廣泛應(yīng)用的重要的腎毒性標(biāo)志物，同時也是反應(yīng)蛋白質(zhì)代謝的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，飼喂含有不同水平的ZEA的飼料后， 100～150 mg/kg添加量的ZEA極顯著提高了各試驗(yàn)組BUN含量，能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的腎臟毒性。本研究腎臟的病理組織學(xué)觀察進(jìn)一步證實(shí)了ZEA對腎臟的毒性損傷。研究證實(shí)，累積在肝臟、腎臟的ZEA能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞萎縮變性，腎小體萎縮，濾過間隙縮小，導(dǎo)致血清中尿素氮升高[11-12]。

血脂主要包括膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)，肝臟是合成TC 和 TG 的主要場所，血清 TC 和 TG 含量反映機(jī)體脂質(zhì)代謝水平。血清膽固醇包括 HDL 和 LDL，LDL 的作用是將膽固醇帶入血管壁內(nèi)并沉積下來，而 HDL 則可以清除黏附在血管壁內(nèi)的膽固醇，降低血脂。血清三酰甘油是脂類代謝過程產(chǎn)生的主要物質(zhì)之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加ZEA對甘油三酯沒有顯著影響，但是總膽固醇含量和低密度脂蛋白、高密度脂蛋白增加，提示脂代謝受到一定程度的影響。成人肝臟和小腸可提供約90%的內(nèi)源性膽固醇，血清膽固醇增高也多見于腎病綜合征。本試驗(yàn)結(jié)果提示，試驗(yàn)劑量的ZEA對小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)雖然造成了輕微損傷，但是脂代謝指標(biāo)，尤其是對LDL含量的影響最為顯著。

3.2 對機(jī)體抗氧化能力的影響氧化應(yīng)激是指機(jī)體的氧化和抗氧化作用失衡，氧化程度超過了氧化物的清除，從而導(dǎo)致組織損傷。T-AOC、T-SOD和GSH-Px是反映機(jī)體清除體內(nèi)活性氧和自由基，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的重要指標(biāo)。肝臟和腎臟是真菌毒素代謝的主要器官，當(dāng)攝入過量真菌毒素時，肝、腎的抗氧化活性將發(fā)生變化。有研究結(jié)果顯示，小鼠飼糧中添加含有霉菌毒素的玉米(AF， ZEN，DON)，肝臟、腎臟、脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并增加其內(nèi)臟指數(shù)，血清和肝臟GPx活性、MDA水平升高，肝、腎T-SOD降低[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加100，150 mg /kg的ZEA，使發(fā)情期和發(fā)情前期血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px含量均極顯著降低，血清中MDA含量極顯著升高，添加量為50 mg /kg的ZEA時，發(fā)情期和發(fā)情前期血清T-SOD、發(fā)情前期的MDA和GSH-Px發(fā)生了極顯著變化。BEN SALAH-ABBES等[13]也證實(shí)，飼料中含有ZEA降低小鼠抗氧化酶活性。當(dāng)仔豬采食了含有鐮刀菌毒素的飼料，血清中T-SOD、GSH-Px含量顯著降低，MDA含量顯著升高[14]，與本研究結(jié)果一致。 但是， ZEA單一毒素對肝、腎重量和細(xì)胞膜脂質(zhì)完整性的作用可能與多種毒素的協(xié)同作用存在差別[15]。飼料中添加100～150 mg/kg ZEA后，發(fā)情前期和發(fā)情期血清中MDA含量極顯著升高，T-AOC、 T-SOD、GSH-Px活性極顯著降低。ZEA顯著降低了機(jī)體的抗氧化能力，具有較強(qiáng)的腎臟毒性。