蒙學(xué)蓮，朱學(xué)亮，張志東

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046)

白細(xì)胞介素需要通過與細(xì)胞表面高親和力的受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)功能[1-2]。白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)的受體(IL-12R) 是由β1鏈(IL-12Rβ1)和β2鏈(IL-12Rβ2)構(gòu)成的異二聚體，屬于I型細(xì)胞因子受體超家族成員，主要表達(dá)于造血來源細(xì)胞表面，包括激活的T細(xì)胞和靜息或激活的NK細(xì)胞等。IL-12由p35和p40等2個亞單位組成，IL-12Rβ1與p40亞單位結(jié)合，IL-12Rβ2與p35亞單位結(jié)合。據(jù)報道，2007年才確定的IL-35與IL-12屬于同一個細(xì)胞因子家族，且也具有p35亞單位，所以IL-12Rβ2是IL-12和IL-35的共享受體，負(fù)責(zé)激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3-4]。IL-12Rβ1在Th1和Th2型細(xì)胞中均有表達(dá)，而IL-12Rβ2 僅在Th1型細(xì)胞表面表達(dá)[5-6]。雖然IL-12Rβ2在未致敏的T細(xì)胞中不表達(dá)，但T細(xì)胞受體(TCR)被抗原結(jié)合后可誘導(dǎo)IL-12Rβ2低水平表達(dá)。因此，IL-12Rβ1和IL-12Rβ2的表達(dá)說明了T淋巴細(xì)胞對IL-12的免疫應(yīng)答，并介導(dǎo)Th1型淋巴細(xì)胞的分化[7]。盡管IL-12R的2個亞單位可以相互獨立地結(jié)合IL-12，但它們之間的相互作用是IL-12信號傳導(dǎo)所必需的。IL-12Rβ2不僅是IL-12信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，而且是看家基因和高親和力的轉(zhuǎn)換器[8]，也是維持IL-12免疫反應(yīng)和控制Th1細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵分子[9-10]。IL-12Rβ2缺乏會減少活化T細(xì)胞的募集，減弱IFN-γ 和TNF-α/LT-α家族炎性細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)[11]。IL-12Rβ2與gp130結(jié)合形成一種受體復(fù)合物，介導(dǎo)IL-35的抗炎性作用[12-13]。此外，IL-12Rβ2對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，當(dāng)其在腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)時可對機體起到保護作用，提示預(yù)后良好[12,14-15]。由此可見，IL-12Rβ2在哺乳動物和其他高等脊椎動物的Th1細(xì)胞的發(fā)育、炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。在試驗擬利用密碼子優(yōu)化技術(shù)表達(dá)并純化了羊源IL-12Rβ2，為制備抗該蛋白的抗體及其在IL-12Rβ2功能研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑pGEM-T-12Rβ2質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建、保存；BL21(DE3)菌種、pET-30a(+)載體購自Promega公司，Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、質(zhì)粒小量提取試劑盒及膠回收試劑盒均購自NEB公司；DNA Marker(DL2000 plus)、PCR產(chǎn)物純化/回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司；卡那霉素購自美國Ameresco公司；鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；抗His標(biāo)簽的單克隆抗體和HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)已獲得的羊IL-12Rβ2基因序列(GenBank登錄號：NM_001252175)，設(shè)計用于擴增IL-12Rβ2基因的PCR引物，在上、下游引物中分別引入酶切位點BamHⅠ和Hind Ⅲ (下劃線部分)(表1)。同時，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化合成羊IL-12Rβ2基因序列，命名為IL-12Rβ2-A，設(shè)計引物。

分別以pGEM-T-12Rβ2重組質(zhì)粒和優(yōu)化合成的IL-12Rβ2-A為模板進(jìn)行PCR擴增，退火溫度均為58℃。雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，對PCR和酶切鑒定的陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET30a-12Rβ2和pET30a-12Rβ2-A。

1.3 表達(dá)條件的篩選和優(yōu)化將過夜培養(yǎng)的pET30a-12Rβ2陽性重組菌液按1%(V/V)轉(zhuǎn)接于含50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，待D600 nm達(dá)到0.6～0.8時，加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，4℃、12 000 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀，加入2×loading buffer，混勻、煮沸變性，8% SDS-PAGE電泳檢測。同時，以未誘導(dǎo)的pET30a-12Rβ2作為陰性對照。

表1 PCR引物

為了提高表達(dá)量，對IL-12Rβ2密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，并對培養(yǎng)基(LB和2×YT)、IPTG濃度(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)、溫度(30℃和37℃)和誘導(dǎo)時間(0,4,6,8,10,12 h)4個影響因素進(jìn)行了篩選，以確定最佳表達(dá)條件。

1.4 重組蛋白的大量表達(dá)和純化根據(jù)1.3確定的最佳表達(dá)條件，對pET30a-12Rβ2-A進(jìn)行大量表達(dá)(2 L)。留心收集菌體，PBS (pH7.4)洗滌3次，按照每克菌體濕重加10 mL PBS的比例重懸；冰浴中超聲裂解，4℃、8 000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀。用溶液Ⅰ(100 mmol/L Tris pH8.0和5 mmol/L EDTA、2% Triton-X-100 和2 mol/L 尿素)和溶液Ⅱ(100 mmol/L Tris pH 8.0和 5 mmol/L EDTA)各洗滌沉淀2次，加適量的8 mol/L尿素(50 mmol/L PBS和 8 mol/L尿素)4℃溶解沉淀過夜；4℃、10 000×g離心30 min，收集上清。用0.45 μm濾器過濾包涵體蛋白溶液，按照鎳瓊脂糖凝膠FF說明書純化包涵體，NanoDrop?ND-1000 分光光度計(Thermo)測定純化蛋白的濃度。8%SDS-PAGE電泳分析。同時，以未誘導(dǎo)的pET30a-12Rβ2作為陰性對照。

1.5 Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入鼠抗His標(biāo)簽的單克隆抗體，4℃孵育過夜；TBST洗膜，加入兔抗鼠IgG，37℃孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光成像分析。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定回收以pGEM-T-12Rβ2為模板擴增獲得的目的基因片段，將目的片段亞克隆至pET30a (+)載體，所構(gòu)建的重組表達(dá)載體經(jīng)PCR、雙酶切鑒定均為陽性(圖1)。同樣，將密碼子優(yōu)化的IL-12Rβ2-A基因也亞克隆至pET30a (+)載體，所構(gòu)建的重組表達(dá)載體經(jīng)PCR、雙酶切鑒定均為陽性。 測序結(jié)果表明，各目的基因已正確插入到表達(dá)載體中且保持正確的閱讀框，分別命名為pET30a-12Rβ2和pET30a-12Rβ2-A(圖2)。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-12Rβ2的鑒定 M.Trans2K Plus DNA Marker；1～3.重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；4.陰性對照；5～7.重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物

2.2 表達(dá)條件的篩選和確定SDS-PAGE分析結(jié)果表明，誘導(dǎo)的pET30a-12Rβ2重組菌能表達(dá)出預(yù)期大小的目的蛋白，但蛋白產(chǎn)量極低，很難滿足試驗需要(圖3)；幸運的是，密碼子優(yōu)化重組菌在誘導(dǎo)下獲得了較高表達(dá)水平的目的蛋白。對表達(dá)條件中的4個因素篩選結(jié)果表明，表達(dá)溫度和誘導(dǎo)時間對重組蛋白產(chǎn)量的基本不影響(圖4)，但培養(yǎng)基和IPTG濃度影響明顯(圖5)。根據(jù)分析結(jié)果，確定pET30a-12Rβ2-A重組菌的最佳表達(dá)條件為：2×YT培養(yǎng)基、37℃、0.8 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)6 h。重組蛋白12Rβ2主要以包涵體形式表達(dá)(圖6)

2.3 重組蛋白的大量表達(dá)和純化在優(yōu)化的表達(dá)條件下，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。將超聲裂解、洗滌后溶解于8 mol/L尿素的包涵體與鎳瓊脂糖凝膠FF混合均勻，用不同咪唑濃度的緩沖液洗脫，SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，pET30a-12Rβ2-A在200 mmol/L咪唑濃度時，目的蛋白的洗脫量最大，雜質(zhì)蛋白量最小(圖7)。根據(jù)NanoDrop?ND-1000分光光度計測定的蛋白濃度計算，每1L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可生產(chǎn)His-12Rβ2重組蛋白2.51mg。

2.4 Western blot分析用抗His標(biāo)簽抗體作為一抗的Western blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的pET30a-12Rβ2-A在預(yù)期約為115 000相對分子質(zhì)量處出現(xiàn)特異性條帶，說明重組蛋白獲得表達(dá)，且與His標(biāo)簽表達(dá)為融合蛋白(圖8)。

3 討論

IL-12Rβ2是IL-12R中負(fù)責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的主要結(jié)構(gòu)，其胞內(nèi)區(qū)的多聚酪氨酸殘基構(gòu)成了與STAT4結(jié)合的位點，當(dāng)受到IL-12信號激活后，STAT4酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核并與核內(nèi)DNA結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ。羊IL-12Rβ2蛋白的功能域保守，包含胞內(nèi)區(qū)保守的酪氨酸殘基和細(xì)胞因子受體超家族的特征性基序，如CXW、WSXWS、box 1和box 2基序[16-18]。WSXWS基序和胞外半胱氨酸殘基可能促進(jìn)與IL-12的相互作用，胞質(zhì)box 1和box 2基序與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[19-20]。WALDVOG等[21]報道，羊IL-12Rβ2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與牛IL-12Rβ2介導(dǎo)的相同。IL-12Rβ2胞質(zhì)區(qū)提供與STAT4蛋白SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點[22-23]。

本試驗將羊IL-12Rβ2基因全長克隆至pET30a (+)載體進(jìn)行蛋白表達(dá)。雖然成功表達(dá)了IL-12Rβ2蛋白，但表達(dá)水平太低，難于滿足后續(xù)試驗的需求。在大腸桿菌中表達(dá)目標(biāo)蛋白的影響因素很多，如密碼子偏性、mRNA二級結(jié)構(gòu)等[24-27]。因此，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化了編碼羊12Rβ2蛋白的密碼子，優(yōu)化基因12Rβ2-A在大腸桿菌中成功表達(dá)且蛋白表達(dá)量顯著提高。鑒于表達(dá)條件對重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的重要性，對培養(yǎng)基、表達(dá)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間等4個因素進(jìn)行了篩選優(yōu)化，以提高重組蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)溫度和誘導(dǎo)時間不影響羊IL-12Rβ2蛋白的表達(dá)水平，培養(yǎng)基和IPTG濃度雖然提高了表達(dá)量，但效果不顯著，且蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。因此，綜合考慮成本和效率，確定羊IL-12Rβ2蛋白的優(yōu)化表達(dá)條件為：2×YT培養(yǎng)基、37℃、0.8 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)6 h。大量表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析表明，成功表達(dá)了目的蛋白羊IL-12Rβ2，且主要以包涵體形式表達(dá)，Ni2+-NTA有效純化目的蛋白，從每1L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可獲得His-12Rβ2重組蛋白2.51mg。這將為后續(xù)進(jìn)一步研究羊IL-12Rβ2功能的試驗奠定了基礎(chǔ)。

圖2 野生型和密碼子優(yōu)化型IL-12Rβ2的序列比對 Wt.野生型；Mt.優(yōu)化型

圖3 pET30a-12Rβ2表達(dá)產(chǎn)物的分析 M.蛋白Marker；1、3.未誘導(dǎo)陰性對照；2、4.誘導(dǎo)6 h產(chǎn)物

圖4 不同誘導(dǎo)溫度和時間下重組蛋白的表達(dá)分析 M.蛋白Marker;A.分別在30℃和37℃誘導(dǎo)6 h產(chǎn)物.A1.未誘導(dǎo)對照;A2.30℃誘導(dǎo)產(chǎn)物;A3.37℃誘導(dǎo)產(chǎn)物.B.37℃不同誘導(dǎo)時間點的產(chǎn)物.B1～B6:分別誘導(dǎo)0,4,6,8,10,12 h產(chǎn)物;.重組蛋白

圖5 不同培養(yǎng)基和IPTG濃度下重組蛋白的表達(dá)分析 M.蛋白Marker.A.37℃、0.8 mmol/L IPTG條件下在不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)6 h;A1.未誘導(dǎo)對照;A2.LB培養(yǎng)基;A3.2×YT培養(yǎng)基;B.37℃、2×YT培養(yǎng)基條件下不同IPTG終濃度誘導(dǎo)6 h;B1～B6.分別是IPTG終濃度0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,0 mmol/L;.重組蛋白

圖6 重組蛋白表達(dá)形式分析 M.蛋白 Marker;1.全菌蛋白;2.可溶性蛋白;3.包涵體

圖8 Western blot分析 M.蛋白Marker;1.未誘導(dǎo)對照;2、3.分別由50,200 mmol/L咪唑洗脫的His-12Rβ2重組蛋白