閆艷娟，張東林，張海龍，李佩國，李蘊(yùn)玉，龐洪澤，張香齋

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066600)

雞球蟲病是一種制約養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的寄生性原蟲病，其分布廣泛，不同日齡雞均可感染，其中雛雞最易感，發(fā)病率和死亡率都很高，耐過雞生長受阻且產(chǎn)蛋性能下降，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。到目前為止，球蟲病的防治主要依賴化學(xué)藥物，但由于化學(xué)藥物的使用不當(dāng)，導(dǎo)致耐藥蟲株產(chǎn)生及藥物殘留等問題，嚴(yán)重影響人們的健康，使得免疫預(yù)防受到關(guān)注[3]。雞球蟲入侵宿主的過程十分復(fù)雜，研究表明，蟲體表面的多種蛋白質(zhì)發(fā)揮著重要的作用。了解這些蛋白質(zhì)的功能和作用，對控制球蟲有一定的幫助。AMA-1是由微線體分泌的一種頂膜抗原，其功能結(jié)構(gòu)域具有良好的保守性，是蟲體侵入過程中重要的一類蛋白[4]。有研究表明，用不同的載體表達(dá)重組AMA-1蛋白或者質(zhì)粒，對雛雞感染E.tenella有一定的保護(hù)作用[5-6]。但關(guān)于AMA-1基因在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性及抗氧化能力尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)將AMA-1抗原與IL-2及真核表達(dá)載體串聯(lián)，轉(zhuǎn)染畢赤酵母細(xì)胞GS115，構(gòu)建表達(dá)載體，應(yīng)用AMA-1基因的重組酵母蛋白進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)，分析其對球蟲感染后的體液免疫水平及抗氧化能力，為研究新的球蟲核酸疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物在河北昌黎某雞場購買1日齡海蘭褐雛雞，飼喂不含抗球蟲藥的飼料至7日齡，糞檢無球蟲卵囊后作為試驗(yàn)雞用。

1.2 蟲株、質(zhì)粒E.tenella河北株孢子化卵囊，預(yù)試驗(yàn)測定其攻蟲量為8×104個(gè)；AMA-1重組酵母蛋白由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化并保存。

1.3 主要試劑IgA、IgG、IgM檢測試劑盒，總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)將150只7日齡雛雞按體質(zhì)量離散度隨機(jī)分成5組，每組30只，1、2組分別為陰性對照組和陽性對照組，3、4、5組分別在7，14，21日齡肌肉注射50，100，150 μg重組AMA-1蛋白，對照組肌注同等量的PBS。28日齡時(shí)，除1組外，每只雞口服E.tenella卵囊8×104個(gè)，在試驗(yàn)后的14，21，28，35 d，每組抽取5只采集心血，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?，試?yàn)至42日齡結(jié)束。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1特異性抗體AMA-1水平的測定 首先用不同濃度的畢赤酵母表達(dá)的重組AMA-1蛋白包被ELISA板，確定抗原與抗體最佳的反應(yīng)濃度[7]，用間接EILSA法測定血清中特異性抗體AMA-1水平。

1.5.2血清IgG、IgM、IgA含量的測定 應(yīng)用IgG、IgM、IgA的ELISA檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，檢測試驗(yàn)后14，21，28，35 d所采集的血清，再用酶標(biāo)儀在相對應(yīng)的波長下檢測樣品吸光度值(D值)，分別在相應(yīng)的回歸方程中計(jì)算樣品IgG、IgM、IgA的含量。

1.5.3抗氧化指標(biāo)測定 T-AOC與GSH-Px活性采用比色法測定，T-SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用SPASS軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血清中特異性抗體AMA-1水平測定結(jié)果由表1可以看出，第1、2組在試驗(yàn)14，21 d的AMA-1抗體水平無顯著差異(P<0.05)，但試驗(yàn)28，35 d時(shí)，2組AMA-1抗體水顯著高于1組(P<0.05)。3、4、5組在試驗(yàn)各期的AMA-1抗體水平均顯著高于1、2組(P<0.05)，其中試驗(yàn)14，21 d時(shí)，4組AMA-1抗體水最高，依次為3組、5組，三者之間均差異顯著(P<0.05)；試驗(yàn)28 d時(shí)，3、4組AMA-1抗體水平顯著高于5組(P<0.05)，但二者無顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)35 d時(shí)，3組AMA-1抗體水平最高，依次為4組、5組，三者之間均差異顯著(P<0.05)。

表1 血清中特異性抗體AMA-1的水平(D值)

注：同列中上標(biāo)字母相同或不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 血清IgG、IgM、IgA含量的測定結(jié)果

2.2.1血清IgG含量 由表2可以看出，在試驗(yàn)14 d，各組血清IgG含量無顯著差異(P>0.05)；在試驗(yàn)21，28，35 d時(shí)，1、2組比較差異不顯著(P>0.05)，但3、4、5組的血清IgG含量顯著高于1、2組(P<0.05)，而3組在試驗(yàn)35 d時(shí)血清IgG含量顯著高于4、5組(P<0.05)。

表2 血清中IgG的含量 g/L

2.2.2血清IgM含量 由表3可以看出，血清IgM含量隨日齡增長而逐漸升高，其中各組在試驗(yàn)14，21，28 d的血清IgM含量無顯著差異(P>0.05)；在試驗(yàn)35 d，3組血清IgM含量最高，與1、4、5組比較差異顯著(P<0.05)，但與2組未達(dá)顯著差異(P>0.05)。

表3 血清中IgM的含量 g/L

2.2.3血清IgA含量 由表4可以看出，血清IgA的含量隨日齡的延長有不同程度的升高，其中各組在試驗(yàn)14，21d的血清IgA含量無顯著差異(P>0.05)；在試驗(yàn)28 d，3、4組血清IgA的含量顯著高于1組(P<0.05)，與2、5組比較差異不顯著(P>0.05)；在試驗(yàn)35 d，3組血清IgA的含量最高，與1、2、4組比較差異顯著(P<0.05)，但與5組比較未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

2.3 血清抗氧化指標(biāo)測定

2.3.1血清T-AOC活性 由表5可以看出，各組在試驗(yàn)14，21 d的血清T-AOC活性均差異不顯著(P>0.05)；在試驗(yàn)28，35 d，3、4、5組的血清T-AOC活性顯著高于1、2組(P<0.05)，但3、4、5組之間的差異不顯著(P>0.05)。

表4 血清中IgA的含量 g/L

表5 血清中T-AOC活性測定結(jié)果 U/mL

2.3.2血清GSH-Px活性 由表6可以看出，在試驗(yàn)14 d時(shí)，各組血中GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)；在試驗(yàn)21，28，35 d時(shí)，3組血清GSH-Px活性最高，與1、2組比較均呈顯著差異(P<0.05)，除35 d的4組外，與4、5組的差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表6 血清中GSH-Px活性測定結(jié)果 μmol/L

2.3.3血清T-SOD活性 由表7可以看出，在試驗(yàn)14，21 d時(shí)，各組血清T-SOD活性差異不顯著(P>0.05)；在試驗(yàn)28，35 d時(shí)，3組血清T-SOD活性最高，與1、2、4、5組比較均達(dá)顯著水平(P<0.05)。

表7 血清中T-SOD活性測定結(jié)果 U/mL

3 討論

目前，對于細(xì)胞免疫和體液免疫在球蟲的免疫機(jī)制中所起的作用還存在異議。有研究表明，在雞球蟲的獲得性免疫中起主要作用的是細(xì)胞免疫[8]。LILLEHOJ等[9-10]將成年雞的胸腺切除，使其喪失T細(xì)胞功能，再進(jìn)行攻蟲，結(jié)果顯示雞對球蟲病的免疫保護(hù)性明顯下降；而切除雞的法氏囊后進(jìn)行攻蟲，發(fā)現(xiàn)雞仍然具有免疫抵抗力。但史民康[11]和劉晶等[12]報(bào)道，雛雞分別感染E.tenella6 d 和E.necatrix10 d 后，血液中的IgG開始增加，至18 d達(dá)到峰值，表明雛雞體液免疫在抵抗球蟲感染中發(fā)揮重要作用。SUBRAMANIAN等[13]以純化的E.maxima配子體為抗原制作亞單位疫苗，再用強(qiáng)毒株感染進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明其能夠很好的預(yù)防雞球蟲病，提示抗體在抗球蟲感染的免疫作用不應(yīng)被忽視。李蘊(yùn)玉等[14-15]報(bào)道，適量的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重組質(zhì)?？娠@著提高機(jī)體的細(xì)胞與體液免疫水平，兩者協(xié)同產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)力，從而抗E.tenella攻擊的保護(hù)率高達(dá)95%。本試驗(yàn)應(yīng)用ELISA方法檢測了免疫重組AMA-1蛋白后血清中特異性抗體及免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的水平，結(jié)果顯示，免疫各組血清AMA-1抗體水平均顯著高于1、2組，尤以3、4組最為明顯。而血清IgG、IgM、IgA含量也呈一定升高趨勢，尤其在試驗(yàn) 35 d(即攻蟲后 7 d)時(shí)，3組血清IgG、IgM、IgA含量顯著高于1、4組(P<0.05)，而血清IgG、IgA含量也顯著高于2組(P<0.05)。說明適量的重組AMA-1蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和免疫球蛋白，從而提高機(jī)體的體液免疫水平，與SUBRAMANIAN等[13]的研究結(jié)果一致。

有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物體內(nèi)的氧自由基可以引起脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，進(jìn)而損害細(xì)胞膜及其生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡、組織損傷甚至引發(fā)疾病。因此，細(xì)胞內(nèi)氧自由基與抗氧化能力的相對平衡是細(xì)胞生存及維持機(jī)體正常生命活動(dòng)的重要因素[16]?？寡趸到y(tǒng)主要包括酶類抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)，二者均可以清除體內(nèi)自由基保護(hù)機(jī)體免受損傷[17]。其中，GSH-Px與動(dòng)物的抗氧化狀態(tài)有直接的關(guān)聯(lián)[18]。T-SOD是重要的抗氧化酶，能催化超氧陰離子的歧化并制止氧自由基的生成，在抵抗體內(nèi)氧自由基防止機(jī)體損傷中發(fā)揮重要作用[19]。T-AOC水平是評價(jià)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的一項(xiàng)重要的綜合性指標(biāo)[20]。付瑩等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射T-2毒素，其血清T-SOD活性降低；李賀等[22]研究發(fā)現(xiàn)，傳染性法氏囊病病毒感染雛雞后，其血清T-SOD、GSH-Px活性均不同程度低于對照雛雞。李佩國等[23]研究證實(shí)，雞感染球蟲后，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，消耗機(jī)體的抗氧化酶，酶的活性也會顯著下降。因此，檢測血清中抗氧化指標(biāo)具有重要的意義。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫各組血清T-SOD、T-AOC、GSH-Px活性較1、2組呈升高趨勢，其中在試驗(yàn) 35 d 時(shí)，3組(重組AMA-1蛋白免疫劑量 50 μg/只)與1、2組比較差異顯著(P<0.05)，而T-SOD、GSH-Px活性也顯著高于4組(P<0.05)。由此表明適宜的重組AMA-1蛋白清除機(jī)體氧自由基的能力升高，保護(hù)機(jī)體免受氧自由基的侵害，從而也會間接刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而起到抗球蟲的效果。