王瑞明，都玉印，相英杰，郭龍宗，李玉燕，李 陽，李建亮，趙 鵬，王一新*，崔言順*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東 泰安 271018； 3.山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018；4.山東益生種畜禽股份有限公司，山東 煙臺 264001；5.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266114)

禽白血病(avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)引起的一種家禽腫瘤性疾病。ALV不僅引起感染雞多種器官發(fā)生腫瘤，還能破壞雞群的免疫功能，導(dǎo)致疫苗免疫失敗，繼發(fā)其他病原感染[1]。鑒于其帶來的巨大危害和經(jīng)濟(jì)損失，國務(wù)院發(fā)布的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》已將禽白血病列為16種優(yōu)先防治的國內(nèi)動物疫病之一。加強禽白血病方面的研究工作對于提高我國動物疫病防控水平、促進(jìn)我國家禽養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，尚無商業(yè)化的藥物或疫苗應(yīng)用于該病的預(yù)防和治療。由于ALV主要通過雛雞早期橫向傳播及雞胚垂直傳播，因此及時檢測并淘汰ALV陽性雞群是防控該病的主要方法[2-3]。

根據(jù)病毒的宿主范圍、病毒間的干擾作用及病毒囊膜蛋白抗原特性，ALV可被分為A～K不同亞群[4]。其中，K亞群ALV(ALV-K)是最近在我國特有地方品系雞群中分離到的一個新亞群[5]。目前，針對該亞群的相關(guān)研究較少，尚無針對ALV-K特異性檢測方法建立的報道。建立一種快速、靈敏的診斷方法對于ALV-K的早期診斷及防控極為重要。檢測ALV的最常用的方法主要有病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、核酸斑點雜交、間接免疫熒光試驗(IFA)及實時熒光定量PCR等。實時熒光定量PCR技術(shù)具有快速靈敏、特異性強、可定量的優(yōu)點，非常適用于病毒感染的早期快速檢測。本試驗以ALV-Kgp85基因為靶標(biāo)，建立了檢測ALV-K的實時熒光定量PCR方法，并對ALV-K感染后病毒在體內(nèi)各器官的分布規(guī)律及載量進(jìn)行了檢測，為ALV-K感染機制的研究提供了支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒ALV-K毒株JS11C1由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授饋贈；A、B、J亞群禽白血病病毒(ALV-A/B/J)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、雞傳染性貧血病病毒(CIAV)、禽呼腸呼病毒(ARV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)由本實驗室保存。雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器病毒RNA提取試劑盒、組織DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；10×Taq 反應(yīng)緩沖液、dNTPs、Prime Star HS DNA 聚合酶、pMD18-T載體、SYBR Premix Ex Taq均購自大連寶生物工程有限公司；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。凝膠成像儀購自Bio-rad公司，7500型熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計下載GenBank中不同亞群ALV代表株的gp85基因序列，使用lasergene 7.0 軟件比對并尋找ALV-Kgp85序列中亞群特異性的保守區(qū)域，應(yīng)用Primer 5.0 軟件設(shè)計針對ALV-Kgp85基因的引物P1/P2。其中，上游引物P1序列為：5′-TGGTCCAGGCCGCAACTCA-3′，下游引物P2序列為：5′-TGCTTGTGCACCCGGTCTCAG-3′，預(yù)期擴增片段長度為222 bp。本試驗所用引物由上海生工公司合成。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備將ALV-K JS11C1株感染DF-1細(xì)胞，維持5 d后收集細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提取細(xì)胞DNA。取1 μg細(xì)胞DNA，加入10×Taq 反應(yīng)緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，50 μmol/L P1/P2引物各1 μL，Prime Star HS DNA 聚合酶0.5 μL，補水至50 μL，將上述反應(yīng)體系混勻后置于PCR儀擴增。參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后復(fù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測并回收純化。純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落振蕩培養(yǎng)12 h，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用P1/P2引物進(jìn)行PCR鑒定，陽性重組質(zhì)粒送上海生工測序。使用分光光度計對重組質(zhì)粒進(jìn)行定量，按以下公式計算重組質(zhì)粒拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(拷貝/μL)=DNA質(zhì)量濃度/DNA相對分子質(zhì)量。其中，DNA質(zhì)量濃度=260 nm吸光度×稀釋倍數(shù)×6.02×1023，DNA相對分子質(zhì)量=DNA堿基數(shù)×324.5。

1.5 實時熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化以陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，將熒光定量PCR上下游引物加入到反應(yīng)體系中，于ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增。使用矩陣法對上下游引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。選用10，25，50 μmol/L的引物濃度進(jìn)行篩選。

1.6 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將1×107拷貝/μL的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋至濃度范圍1×107～1×100拷貝/μL，以其為模板，在最佳反應(yīng)條件下同時擴增，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)監(jiān)測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 實時熒光定量PCR的敏感性、特異性和重復(fù)性檢測將1×107拷貝/μL的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋至濃度范圍1×107～1×100拷貝/μL，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，進(jìn)行敏感性檢測。同時以等量的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，取擴增產(chǎn)物5 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，計算2種方法所能檢測出的最低模板濃度，比較兩者敏感性的差異。

分別以ALV-A/B/J、REV、MDV、CAIV、ARV的DNA或cDNA為模板，使用所建立的實時熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，同時設(shè)置去離子水為陰性對照。

對不同梯度濃度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，每個梯度進(jìn)行3次反應(yīng)，通過組內(nèi)的Ct值變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值平均數(shù))評估所建立方法的重復(fù)性。另外，取3份ALV-K感染雞的肝臟樣品，以其組織DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測，分析該方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)：將上述3份DNA分別設(shè)立3個重復(fù)，在同一條件下同時檢測，計算批內(nèi)變異系數(shù)；批間重復(fù)：將上述3份DNA在同一條件下進(jìn)行3次獨立的熒光定量PCR檢測，計算批間變異系數(shù)。

1.8 SPF雛雞人工感染試驗取SPF雞胚60枚，分為2組：ALV-K攻毒組和空白對照組，每組30枚雞胚。在6胚齡時，攻毒組每枚雞胚通過卵黃囊接種104TCID50的ALV-K JS11C1毒株，對照組通過卵黃囊接種相同體積的PBS緩沖液。雞胚孵出后，所有試驗雞在相同條件的隔離罩中隔離飼養(yǎng)。分別于接種后1,3,7,14,21,28,35,42 d隨機選取攻毒組和對照組各5只雞剖殺，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊，通過DNA提取試劑盒提取組織DNA，使用本研究建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行病毒載量的檢測。

2 結(jié)果

2.1 ALV-Kgp85基因的PCR擴增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建以感染ALV-K的DF-1細(xì)胞DNA為模板，使用P1/P2引物進(jìn)行PCR擴增，獲得222 bp的特異性條帶。將其回收純化并克隆至pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-gp85。重組質(zhì)粒的雙酶切檢測結(jié)果顯示，pMD18-gp85上攜帶有200 bp左右的片段，與預(yù)期大小一致。測序結(jié)果進(jìn)一步證實，擴增得到的片段與參考序列同源性達(dá)到99.9%。使用試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，分光光度計測定濃度為610 mg/L，D260/D280為1.85，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實時熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化對實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定引物的最佳濃度分別為10 μmol/L。反應(yīng)體系為20 μL，其中含10 μL 2×Premix Ex Taq Mix緩沖液，Rox reference dyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，用去離子水補足體積。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s(收集熒光信號)，擴增40個循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立使用優(yōu)化后的條件進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以10倍梯度濃度稀釋的pMD-18-gp85為模板擴增，獲得了檢測ALV-Kgp85基因的擴增曲線(圖1A)。結(jié)果顯示，該方法在模板濃度為107～100拷貝/μL具有良好的線性關(guān)系，R2值達(dá)到0.999。pMD-18-gp85熒光定量PCR熔解曲線如圖1B所示，可見在Tm=87.2℃附近出現(xiàn)單一特異峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物。圖2為AVI公司SDS分析軟件生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值(X)，縱坐標(biāo)為Ct值。拷貝數(shù)對數(shù)值(X)與Ct值的關(guān)系為y= -2.954x+31.633。

圖1 實時熒光定量PCR檢測的擴增曲線和溶解曲線 A.擴增曲線；B.溶解曲線;1.1.0×107拷貝/μL;2.1.0×106拷貝/μL;3.1.0×105拷貝/μL;4.1.0×104拷貝/μL;5.1.0×103拷貝/μL;6.1.0×102拷貝/μL;7.1.0×101拷貝/μL;8.1.0拷貝/μL;9.空白對照

圖2 實時熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 實時熒光定量PCR的敏感性、特異性和重復(fù)性試驗結(jié)果通過對重組質(zhì)粒pMD18-gp85各稀釋度樣品進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示本方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行擴增最低可以檢測到1個病毒核酸分子拷貝，而常規(guī)PCR方法在100個病毒拷貝時能觀察到目的條帶(圖3)。這表明，本試驗所建立的實時熒光定量PCR方法比普通PCR高出約100倍。用所建立的實時熒光定量PCR方法對ALV-A/B/J、REV、MDV、CAIV、ARV的DNA或cDNA進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均無擴增信號，而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品有良好的擴增，表明該方法具有良好的特異性。取3份ALV-K感染雞的肝臟，提取組織DNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測并對擴增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)的變異系數(shù)均小于2%(表1)，表明該方法具有良好的重復(fù)性，可以進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測。

2.5 ALV-K感染雞體內(nèi)病毒分布及病毒載量的檢測將ALV-K原型株JS11C1通過卵黃囊途徑接種SPF雞胚，雛雞孵出后，分別于接種后1，5，7，14，21，35，42 d剖檢感染組和空白對照組雞，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺和法氏囊等器官，通過DNA提取試劑盒提取組織DNA，利用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測各臟器中病毒分布和載量。結(jié)果表明，在檢測的時間點內(nèi)，各組織中均能檢測到病毒存在(圖4)。其中，心臟、脾臟、肺臟、腎臟中病毒含量相對較多；雛雞孵出后1～21 d病毒載量變化不大，35 d后各組織中病毒載量顯著降低。對照組雞在試驗期間檢測結(jié)果均呈陰性。

圖3 常規(guī)PCR敏感性試驗 M.DL2000 DNA Marker;1.1.0×107拷貝/μL;2.1.0×106拷貝/μL;3.1.0×105拷貝/μL;4.1.0×104拷貝/μL;5.1.0×103拷貝/μL;6.1.0×102拷貝/μL;7.1.0×101拷貝/μL;8.1.0拷貝/μL;9.空白對照

表1 熒光定量PCR檢測的重復(fù)性試驗

圖4 感染ALV-K雞不同組織器官中病毒拷貝數(shù)的比較

3 討論

ALV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、反轉(zhuǎn)錄病毒屬，其基因組是由gag、pol和env等3個編碼基因及兩端的非編碼序列LTR組成的。其中，env基因編碼gp85和gp37等2種糖蛋白，gp85為表面蛋白，它與宿主的中和反應(yīng)以及病毒的致病特性密切相關(guān)，同時也是ALV亞群分類的依據(jù)。ALV-K是近年來在我國地方品系雞群中分離到的一個新亞群病毒，原型株為分離自我國蘆花雞群的JS11C1株[5]。序列分析表明，JS11C1株gp85基因與其他亞群gp85基因的同源性僅為38.3%～82.7%[6]。當(dāng)通過卵黃囊或雞胚靜脈途徑接種病毒時，JS11C1可以誘發(fā)持續(xù)性病毒血癥、降低雞群對新城疫滅活疫苗和H9亞型禽流感滅活疫苗的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)、并可誘發(fā)淋巴細(xì)胞腫瘤(待發(fā)表文章)。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，近年來ALV-K在我國的檢出率呈上升趨勢，我國多個地方品系雞種如蘆花雞、東鄉(xiāng)黑雞、龍勝鳳雞等廣泛存在ALV-K的感染，嚴(yán)重威脅著我國地方品系雞群的飼養(yǎng)和繁育[7-9]。

目前，世界范圍內(nèi)尚無商業(yè)化的藥物或疫苗可應(yīng)用于ALV的預(yù)防和治療，及時淘汰ALV陽性雞群是防控該病的主要方法，建立一種快速、靈敏的檢測方法對于ALV-K的早期診斷極為重要。目前，常使用的ALV病原檢測方法包括病毒分離鑒定、免疫熒光試驗、核酸雜交技術(shù)等[10-12]。病毒分離鑒定和免疫熒光試驗對實驗室的硬件條件和操作者的技能要求較高，不適合廣泛推廣；核酸雜交技術(shù)雖然操作相對簡單，結(jié)果判斷準(zhǔn)確直觀，但也需要 2 d時間；而實時熒光定量 PCR技術(shù)相對于常規(guī)PCR等檢測方法，不僅有著更高的特異性和靈敏度，而且大大縮短了檢測時間[13]。

本試驗通過比對不同亞群ALVgp85基因的序列，設(shè)計了1對針對ALV-Kgp85基因的特異性引物，通過對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了快速檢測ALV-K的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。該方法最低可檢測到初始模板中1個拷貝的病毒核酸，其靈敏度是常規(guī)PCR的100倍。特異性和重復(fù)性檢測結(jié)果表明，該方法與其他常見免疫抑制性病原以及ALV其他亞群病毒均無交叉反應(yīng)；無論是批內(nèi)重復(fù)試驗還是批間重復(fù)試驗，其Ct值的變異系數(shù)均在2%以下。本試驗所建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好，為ALV-K的快速診斷和病毒準(zhǔn)確定量奠定了基礎(chǔ)。

由于K亞群是在我國地方品系雞群中最新分離到的ALV亞群，因此目前針對ALV-K致病性及其致病機制的研究報道較少。本試驗將ALV-K原型株JS11C1通過卵黃囊接種SPF雞胚，利用所建立的熒光定量PCR方法，對感染雞體內(nèi)各組織器官的病毒分布及病毒載量進(jìn)行了檢測。由于ALV在感染雞體過程中，需要將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并整合到宿主基因組中，因此本試驗直接從雞組織器官的DNA中檢測病毒核酸。結(jié)果顯示，在雛雞出殼后的42 d內(nèi)，均可檢測到病毒存在，心臟、脾臟、肺臟、腎臟中病毒含量相對較多。董征英等[14]報道，ALV-J感染雛雞后，雞的胸腺、肺臟、脾臟、法氏囊、腎臟、心臟病毒含量依次降低，病毒分布規(guī)律的差異有可能與病毒亞群或者攻毒方式有關(guān)。此外，在雛雞孵出后1～21 d病毒載量變化不大，35 d后各組織中病毒載量顯著降低，但胸腺和法氏囊中病毒含量仍相對較高。這提示，淋巴細(xì)胞有可能是ALV-K感染雞體的靶細(xì)胞，這與我們前期動物試驗驗中ALV-K感染可誘發(fā)雞的淋巴細(xì)胞腫瘤相吻合。

本試驗建立了針對ALV-Kgp85基因的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法，該方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，可作為ALV-K早期感染的重要檢測手段，該方法同時為ALV-K感染機制的研究提供了良好的技術(shù)支持。