錢 晶，歐陽偉，王晶宇，孫偉偉，王曉麗，夏興霞，諸玉梅，王永山

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇 南京 210014)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強毒株感染引起的一種急性、高度接觸性禽類烈性傳染病[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將ND列為必須報告的動物疫病。我國將其列為一類動物疫病，并在《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中列為優(yōu)先防治和重點防控的動物疫病之一[2]。近年來，我國ND呈現(xiàn)出新的流行病學特點：非典型性ND和免疫帶毒現(xiàn)象普遍存在，免疫失敗時有發(fā)生，直接及間接造成的經(jīng)濟損失巨大，ND的防控面臨著新挑戰(zhàn)[3-4]。因此，尋求防控ND的新途徑已成為亟待解決的重大科學與生產(chǎn)實際問題。

NDV為副黏病毒科副黏病毒屬的禽副黏病毒I型，基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，可編碼6個結(jié)構蛋白(NP、P、M、F、HN、L)和2個非結(jié)構蛋白(V、W)[1]。NP、P和L作為內(nèi)部蛋白參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄與復制，形成有活性的mRNA[5-6]；M蛋白構成囊膜內(nèi)表面的支撐物，并驅(qū)動病毒出芽[7-8]；F和HN是形成病毒表面纖突的糖基化蛋白，也是決定NDV毒力和致病性的主要因素[9-10]。另外，V蛋白能通過多種策略拮抗宿主I型IFN信號通路[11-13]。然而，目前有關W蛋白的功能及其作用機制尚不明確。

為此，本試驗選取遺傳背景清晰的新城疫病毒信息，利用生物信息學軟件分析W蛋白的遺傳進化規(guī)律、潛在的蛋白質(zhì)修飾位點以及高級結(jié)構等，獲得其分子特征，并以此預測W蛋白的功能結(jié)構域，為深入解析新城疫病毒W(wǎng)蛋白的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株信息與W蛋白序列確定從GenBank上選取24株信息完整、可信度高的NDV毒株序列(表1)，采用BioEdit軟件在病毒P基因開放閱讀框第401位插入2個G堿基，尋找W基因編碼區(qū)，翻譯成氨基酸(amino acid，aa)序列，確定各毒株的W蛋白序列。

1.2 遺傳進化分析采用MEGA6.06軟件對24條W蛋白序列進行遺傳進化分析，運用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹，bootstrap設置1 000次重復。

1.3 蛋白修飾位點預測應用NetNGlyc 1.0 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetPhos 3.1 Server在線軟件分析W蛋白中N側(cè)鏈糖基化、O側(cè)鏈糖基化以及磷酸化修飾位點與激酶結(jié)合位點的數(shù)量和種類。

1.4 信號肽、跨膜區(qū)及核定位信號預測應用SignalP-5.0 Server、TMHMM Serverv.2.0和cNLS Mapper在線軟件分析W蛋白中信號肽、跨膜區(qū)及核定位信號情況。

1.5 高級結(jié)構預測應用SOPMA和I-TASSER在線軟件綜合分析W蛋白的二級結(jié)構，確定α螺旋、β轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲等的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 W基因及其編碼蛋白序列長度分析P、V、W蛋白具有共同的氨基末端(N端，第1～134位)，但羧基末端(C端)不同，W蛋白長度的差異是通過改變C端結(jié)構域長度來實現(xiàn)的。由表1可見，不同毒株W蛋白序列長度各有不同，目前存在8種不同長度，分別為137aa、147aa、155aa、179aa、183aa、196aa、221aa和227aa。ClassⅠ毒株W蛋白均為183aa；在ClassⅡ中基因Ⅰ型毒株均為147aa，基因Ⅱ型弱毒株和基因Ⅴ型毒株均為179aa，基因Ⅱ型中強毒株均為221aa，基因Ⅲ、Ⅵ和Ⅶ型強毒株均為227aa，基因Ⅳ型毒株均為196aa，基因Ⅷ型毒株均為155aa，基因Ⅸ型毒株均為137aa。除基因Ⅸ型強毒株W蛋白序列長度較短外，NDV強毒株(包括中強毒)W蛋白序列長度均較長，表現(xiàn)為不同基因型毒株W蛋白長度差異又與強、弱毒特征存在一定相關性。

2.2 遺傳進化樹分析根據(jù)W蛋白氨基酸序列繪制遺傳進化樹，結(jié)果顯示基于W蛋白序列的基因型劃分情況與已報道的各毒株基因型相同，各基因型組內(nèi)毒株高度同源，盡管基因Ⅱ型毒株中存在2種序列長度，但由進化樹可見其W蛋白變異水平均在同一分支內(nèi)，表明不同毒株W蛋白變異呈現(xiàn)基因型一致性(圖1)。

2.3 糖基化和磷酸化修飾位點分析N-糖基化預測結(jié)果顯示，所有毒株的N-糖基化位點均在P/V/W共有區(qū)，除3株(IT-227/82、ZJ1、HB/1/05/Dk)包含有2個N-糖基化位點，其余毒株均為1個。O-糖基化預測結(jié)果顯示，各毒株所包含的O-糖基化位點數(shù)量趨于基因型一致，其中基因Ⅱ型中強毒、基因Ⅲ型和基因Ⅶ強毒株C端O-糖基化位點數(shù)量顯著多于其他毒株(表2)。磷酸化預測結(jié)果顯示，所有毒株的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾位點數(shù)量同樣趨于基因型一致，基因Ⅶ強毒株W蛋白上絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾位點數(shù)量最多，磷酸化位點數(shù)量差異主要出現(xiàn)在W蛋白C端結(jié)構域(第135位aa開始)(表3)。由此可見，基因Ⅱ型中強毒株與基因Ⅲ、Ⅵ和Ⅶ型強毒株W蛋白上潛在糖基化和磷酸化位點數(shù)量較多可能與W蛋白長度有關，提示W(wǎng)蛋白上糖基化位點和磷酸化位點數(shù)量與其長度呈正相關性。

表1 新城疫病毒W(wǎng)基因及其編碼蛋白長度統(tǒng)計

圖1 W蛋白的遺傳進化樹

2.4 核定位信號分析跨膜結(jié)構和信號肽分析表明所有W蛋白均無跨膜區(qū)和信號肽區(qū)域。核定位信號分析表明所有W蛋白存在1個約30aa長度的核定位信號序列，基因2型毒株W蛋白核定位序列位于第138～168位，其他所有毒株核定位序列均位于第106～136位，并且毒株間核定位序列同源性較高(表4)。這表明W蛋白具有入核潛能，推測W蛋白的功能活動區(qū)可能在細胞核。

2.5 二級結(jié)構分析二級結(jié)構預測分析表明，所有W蛋白存在4種結(jié)構形式，分別為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中無規(guī)則卷曲結(jié)構含量最高，其次為α-螺旋。W蛋白包含有至少3個α-螺旋結(jié)構域，通過序列比對發(fā)現(xiàn)基因Ⅱ型(編碼221aa的BC株和TX/GB株)和基因Ⅲ、Ⅵ和Ⅶ型(編碼227aa)NDV在其C端結(jié)構域均(第206～221/225位)額外存在1個α-螺旋結(jié)構域(表5，圖2)，這一結(jié)構域的存在是否與毒力相關還有待進一步研究。

表2 W蛋白潛在糖基化位點統(tǒng)計

表3 W蛋白潛在磷酸化位點統(tǒng)計

表4 W蛋白潛在核定位信號統(tǒng)計

表5 W蛋白二級結(jié)構預測統(tǒng)計 %

圖2 W蛋白羧基端序列比對及二級結(jié)構預測

3 討論

新城疫病毒P基因在轉(zhuǎn)錄過程中通過“RNA編輯”作用，分別產(chǎn)生2個非結(jié)構蛋白(V和W)，其中W蛋白是最短編碼產(chǎn)物[5,14]。最早，CHAMBERS等[15]通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)2個約36 000和33 000大小的條帶，將其鑒定為V和W蛋白。MEBATSTION等[16]發(fā)現(xiàn)，編碼P、V、W基因的轉(zhuǎn)錄體比例分別為68%，29%和2%。WAKAMATSU等[17]在研究V蛋白的過程中，推測W蛋白可能與NDV毒力和致病性有關，但未得到確切證實。國內(nèi)對W蛋白的研究也僅停留在蛋白表達及其抗體制備方面，并未有深入研究。近期國內(nèi)學者分析不同毒力的NDV毒株感染初期RNA編輯動力學，發(fā)現(xiàn)強毒株W基因的轉(zhuǎn)錄體比例與之前的報道有所差異，明顯高于弱毒株的轉(zhuǎn)錄體比例[18]，提示強毒株W蛋白可能參與病毒的感染與復制。

NDV具有遺傳多樣性，分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，每類又可進一步分為多種基因型，其中ClassⅡ 至少包括18個基因型[19]。分子流行病學監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，我國目前流行的NDV以ClassⅡ類中的基因Ⅵ型和Ⅶ型為主，個別地區(qū)還出現(xiàn)了新基因型[2]。本試驗發(fā)現(xiàn)不同毒株W蛋白序列長度呈現(xiàn)基因型一致性，不同基因型毒株W蛋白長度差異又與強、弱毒特征存在一定相關性，W蛋白長度的差異是通過改變C端結(jié)構域長度來實現(xiàn)的。最近，KARSUNKE等[20]發(fā)現(xiàn)，Clone 30株(基因Ⅱ型)C端結(jié)構域核定位序列(NLS)的突變會改變W蛋白的細胞定位情況，然而不同基因型NDV毒株W蛋白長度具有多樣性，并且基因Ⅱ型毒株與其他毒株W蛋白的核定位序列存在差異，這使得毒株間W蛋白定位及功能可能存在不同作用模式，這有待進一步研究論證。

本試驗結(jié)果表明，W蛋白序列具有長度多樣性，與病毒毒力存在一定相關性；W蛋白長度的差異是通過改變C端結(jié)構域長度來實現(xiàn)的，蛋白修飾位點數(shù)量與其長度呈正相關性，強毒株C端結(jié)構域存在額外的α-螺旋結(jié)構，推測W蛋白可能是NDV強毒株上關鍵的新型毒力標志。另外，W蛋白存在穩(wěn)定的核定位信號，提示其功能活動區(qū)可能在細胞核。這將對W蛋白功能挖掘以及深入理解NDV感染機制提供新的理論基礎。