卜 研，薛向紅，閆喜軍，朱翔宇，胡 博，史 寧

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130122)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)感染犬科和其他食肉動(dòng)物而引起的一種急性熱性、高度接觸性傳染病[1]，該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率高。自然感染宿主不斷擴(kuò)大，包括犬科、鼬科、浣熊科、貓科，海豹科、偶蹄目豬科、以及獼猴屬。CDV經(jīng)常引起大批寵物犬、貉、狐等發(fā)病，致死率30%～80% ，雪貂的致死率可達(dá)100%，犬瘟熱對犬、毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物、野生動(dòng)物的生命安全造成嚴(yán)重威脅，給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-7]。犬瘟熱病毒為副黏病毒科(Paramyxovaridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)成員，CDV基因組為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，由15 690 bp核苷酸組成，依次有6個(gè)開放閱讀框，分別為核蛋白 (N) 、磷蛋白 (P) (內(nèi)部含有2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白基因C和V)[8]、基質(zhì)蛋白 (M) 、融合蛋白 (F) 、血凝素蛋白 (H) 和大聚合酶蛋白 (L)。

CDV Hebei株是2010年從北極狐中分離到的犬瘟熱病毒，它可在不同動(dòng)物間發(fā)生種間水平傳播，屬于犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株[9]。研究表明，犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株經(jīng)過適應(yīng)細(xì)胞后，毒力會(huì)減弱[10]。因此，本試驗(yàn)旨在從基因組水平分析犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株適應(yīng)細(xì)胞前后，病毒基因組核苷酸序列的變異情況。 我們首先對適應(yīng)Vero-dSlam細(xì)胞后的HBF-1的全基因組序列進(jìn)行了測定。然后，與最初分離株Hebei株的全基因組序列進(jìn)行全面比對和序列分析，明確變異發(fā)生的具體位點(diǎn)，這些為后續(xù)研究強(qiáng)毒株與Slam受體相互作用及建立反向遺傳操作平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒和主要試劑北極狐源犬瘟熱病毒Vero-dSlam細(xì)胞適應(yīng)株HBF-1，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物疫病防控研究室保存；總RNA提取試劑盒RNeasy mini kit購自QIAGEN；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscripTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix購自invitrogen；高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase，pEASY-Blunt Cloning Kit，感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Axygen。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中已經(jīng)公布的23株犬瘟熱病毒的全基因組序列，比對分析后，利用Primer Premier 5.0在保守區(qū)設(shè)計(jì)了11對特異性引物F1/R1～F11/R11(具體序列見表1)，引物送由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 總RNA提取根據(jù)QIAGEN總RNA試劑盒的說明書提取總RNA。取200 μL Vero-dSlam細(xì)胞適應(yīng)株HBF-1病毒液到無RNA酶的1.5 mL離心管中，加入350 μL RLT，將病毒液充分裂解，加入550 μL 70%乙醇吹打混勻，取700 μL到新的2 mL column tube中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入700 μL RW1，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；加入500 μL RPE，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；再加入500 μL RPE，12 000 r/min離心1 min，棄廢液；將吸附柱放到新2 mL離心管中，12 000 r/min 空離心1 min；重新將吸附柱放到無RNA酶污染的新1.5 mL離心管中，加入30 μL Rnase free water到膜上，12 000 r/min離心1 min；測定濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于RT-PCR反應(yīng)。

1.4 RT-PCR反應(yīng)

1.4.1RNA反轉(zhuǎn)錄 取Annealing Buffer 1 μL、50 μmol/L Oligo(dT)20primer 1 μL、50 mg/L random primer 1 μL、RNA 5 μL，將以上試劑加到0.2 mL 薄壁PCR管上，冰上混勻，在65℃孵育5 min，立即放冰上1 min，之后加入2×first-strand reaction mix 10 μL、SuperScriptTMⅢ/RNaseoutTMEnzyme Mix 2 μL，混勻短離心，50℃孵育50 min。

表1 擴(kuò)增用引物序列

1.4.2cDNA PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增用50 μL體系：即5×TransStartFastPfuBuffer 10 μL、TransStartFastPfu DNA Polymerase(2.5 U/μL)1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL、上、下游引物各(20 μmol/L)1 μL、無菌水31 μL、cDNA 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min,95℃變性20 s,45～61℃退火20 s，72℃延伸90 s,循環(huán)40次，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定正確后，進(jìn)行膠回收。

1.5 全基因的克隆與序列測定分別將膠回收的11個(gè)片段連接到pEASY-Blunt載體上，即4 μL的目的片段加入到1 μL載體中，25℃連接20 min，反應(yīng)結(jié)束后放到冰上，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，12 h之后挑菌，用Amp抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，將初步鑒定正確的質(zhì)粒送到上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.6 序列分析利用DNAstar軟件中的Seqman工具對所獲得的11個(gè)片段序列進(jìn)行拼接，找出開放閱讀框的位置與數(shù)目，利用MegAlign將拼接好的全序列與GenBank的CDV基因組全序列進(jìn)行同源率分析和氨基酸比對。并利用MEGA6.0軟件對HBF-1H基因與GenBank中其他已知CDV毒株的H基因進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果以11對所設(shè)計(jì)的特異性引物用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增所需基因獲得11個(gè)目的片段(圖1)。11個(gè)目的片段長度依次約為1 200，1 500，1 500，1 900，1 500，1 700，1 500，1 500，1 300，2 100，1 800 bp，與預(yù)期相符。

圖1 犬瘟熱病毒HBF-1株全基因組擴(kuò)增結(jié)果 1～11.分別為引物F1～F11的擴(kuò)增產(chǎn)物；M.Marker

2.2 狐源CDV基因組的序列測定及拼接將RT-PCR獲得的11個(gè)片段進(jìn)行克隆與測序，利用DNAstar中的SeqMan軟件將分段克隆獲得的CDV HBF-1基因組序列進(jìn)行拼接，從而獲得CDV HBF-1株的全基因組序列，分析結(jié)果表明，狐源CDV基因組全長為15 690 nt，與GenBank上登錄的CDV基因組大小一致，3′端前導(dǎo)序列和5′端尾隨序列分別有52和38個(gè)核苷酸組成，其中N、P、M、F、H和L蛋白ORF基因大小分別為1 569，1 521，1 005，1 986，1 821，6 552 nt(表2)。2個(gè)相鄰結(jié)構(gòu)蛋白基因之間的非編碼區(qū)序列都包含一個(gè)終止信號和半保守的多聚腺苷酸化和基因間非轉(zhuǎn)錄三聯(lián)核苷酸CUU(H和L基因間為CUA，L基因和5′端尾隨序列為CAA)，猜測基因間隔序列與轉(zhuǎn)錄信號有關(guān)[11]。

表2 狐源犬瘟熱病毒基因編碼蛋白及基因間隔序列

2.3 狐源基因組序列與其他株CDV同源性分析利用MegAlign對HBF-1株和GenBank上公布的21株CDV全基因組序列進(jìn)行比對分析。HBF-1株為犬瘟熱病毒河北狐源分離株Hebei的Vero-dSlam細(xì)胞適應(yīng)株，因此兩者同源率最高，為99.8%(圖2)。HBF-1株與A75/17株(America-1型強(qiáng)毒株) 的親緣關(guān)系近，同源率最高，同源率為96.2%，與疫苗株Onderstepoort、Snyder Hill、CDV-3的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，同源率相對較低，分別為92.7%，92.8% 和92.7%(圖2)。由地域分型可看出HBF-1株與HLJ-06(黑龍江)亞洲地區(qū)毒株親緣關(guān)系較近，同源性為98.5%。HBF-1株與其他CDV全基因組同源率分別為：01-2689(95.6%)、007LM(94.6%)、011C(94.5%)、50Con(94.6%)、55L(94.5%)、98-2646(94.8%)、98-2654(94.8%)、002601(95.6%)、5804P(95.5%)、164071(96.1%)、CYN07-hv(97.7%)、M25CR(94.5%)、Phoca-Caspian-2007(92.8%)和Shuskly(92.8%)。

圖2 CDV-HBF-1株全基因組與其他CDV基因組同源性比較

2.4 HBF-1株氨基酸序列分析由于分離株Hebei與Vero-dSlam細(xì)胞適應(yīng)株HBF-1的全基因組核苷酸序列存在0.2%的差異。因此，使用DNAstar軟件對HBF-1株與Hebei株不同核苷酸位點(diǎn)所對應(yīng)編碼位點(diǎn)進(jìn)行了比對，發(fā)現(xiàn)一些保守氨基酸發(fā)生突變(表3)，這些突變可能對蛋白的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象產(chǎn)生影響[12]。

表3 HBF-1株與Hebei 株的編碼區(qū)保守氨基酸處氨基酸突變位

注：a.全基因組中核酸的位置；b.每個(gè)蛋白中氨基酸的位置;c.“-”為非編碼區(qū)

將CDV HBF-1株的H氨基酸序列與其他強(qiáng)毒株和疫苗株比對顯示，各疫苗株在固定位點(diǎn)有確定氨基酸的變化，而各強(qiáng)毒株的氨基酸的變化沒有特定的規(guī)律(圖3)。H基因是CDV的主要抗原性保護(hù)基因，也是變異率最高的基因，因此通常被用于CDV進(jìn)行基因分型[13]。運(yùn)用DNAstar和MEGA6.0軟件對所擴(kuò)增的 HBF-1H基因組與GenBank中其他CDV毒株的H基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，HBF-1株與HLJ1-06毒株親緣關(guān)系較近(圖4)，其同源率為98.5%，屬于Asia-1型，與國際標(biāo)準(zhǔn)疫苗株Onderstepoort同源率較低，僅為92.7%，與國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株A75/17同源率高達(dá)96.2%，可以確定CDV-HBF-1毒株為Asia-1型強(qiáng)毒株。

3 討論

近年來，國內(nèi)外犬瘟熱發(fā)病趨勢呈現(xiàn)上升狀態(tài)，免疫接種的動(dòng)物也有發(fā)病報(bào)道[14-15]，犬瘟熱病毒的自然感染宿主范圍不斷擴(kuò)大，甚至可感染非人靈長類[16-17]，因此，對野毒株進(jìn)行全基因組序列分析有重要意義。本研究獲得了分離株Hebei的Vero-dSlam細(xì)胞適應(yīng)株HBF-1，對HBF-1株的全基因組進(jìn)行了序列測定和分析。首先以GenBank中已公布的CDV全基因組序列的相對保守區(qū)為模板，設(shè)計(jì)11對特異性引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增獲得11個(gè)目的片段。然后，將11個(gè)片段純化后，連接至平端載體pEASY-Blunt上，進(jìn)行序列測定，每個(gè)堿基位點(diǎn)保證測序6～8次，最后拼接獲得HBF-1全基因組序列。對HBF-1全基因組序列分析結(jié)果顯示：HBF-1株基因組全長為15 690 nt，從3′到5′端依次編碼N、P、M、F、H和L 6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其ORF框大小分別為1 569，1 521，1 005，1 986，1 821，6 552 nt。將HBF-1株與Hebei株核苷酸比對可知，在基因的非編碼區(qū)和編碼區(qū)都存在核苷酸變異，但與其他CDV毒株比對發(fā)現(xiàn)，各個(gè)毒株在結(jié)構(gòu)基因的起始和終止位置基本一致，基因長度和其基因間隔序列也基本相同，說明CDV的基因結(jié)構(gòu)在遺傳上是相對保守的，這與之前報(bào)道一致[18]。通過與GenBank中已公布的其他CDV毒株的同源率分析可知，HBF-1株與HLJ-06株同源性最高為98.5%，而與CDV3、Onderstepoort等疫苗株相似性較低，同源率都為92.7%，HBF-1株為Asia-1型強(qiáng)毒株。

圖3 CDV各個(gè)毒株H蛋白氨基酸序列分析

圖4 基于H基因氨基酸序列的不同CDV毒株遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹

CDV HBF-1株與最初的分離毒Hebei株序列比對發(fā)現(xiàn)，在其編碼區(qū)有13處氨基酸發(fā)生了變異，我們推測，這些變異很有可能是在病毒適應(yīng)細(xì)胞過程中產(chǎn)生的。 但是目前尚不清楚CDV強(qiáng)毒株Hebei適應(yīng)細(xì)胞后，病毒HBF-1的毒力和致病性是否發(fā)生改變，這些變異與病毒毒力和致病性的具體關(guān)系，仍需要后續(xù)進(jìn)一步研究。研究表明，CDV H蛋白的 542 位突變?yōu)?N和549 位突變?yōu)?H，可引起當(dāng)?shù)厝翢岜┌l(fā)，發(fā)病動(dòng)物死亡率較高[19]。犬源與非犬源CDV在H基因氨基酸530和549位點(diǎn)上有顯著差異，其中犬源CDV多為549Y，非犬源(狐貍、水貂、貉等)CDV則更趨向于549H[6]，狐源CDV HBF-1株的H氨基酸序列與其他強(qiáng)毒株和疫苗株的比對結(jié)果顯示，HBF-1的H蛋白出現(xiàn)了2處氨基酸突變，549位由Y突變?yōu)镠，這將增加CDV HBF-1毒株對其他宿主的感染和適應(yīng)能力。另外F和H蛋白共同介導(dǎo)了相鄰細(xì)胞間的融合作用[20]，HBF-1株與Hebei株比對顯示，F(xiàn)和H蛋白都有2處氨基酸突變，這可能影響蛋白的二級結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而對適應(yīng)細(xì)胞和促使細(xì)胞間膜融合產(chǎn)生影響。