辛佳亮，汪 偉，杜 倩，韓知曉，閉璟珊，孔子榮，張書祥，孫文超，曹 亮，魯會軍，鄭 敏，金寧一1,*

(1.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530000；3.溫州大學 病毒學研究所，浙江 溫州 325035；4.軍事醫(yī)學科學院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122)

豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型豬圓環(huán)病毒，屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種共價閉合、無包膜的單股環(huán)狀DNA病毒[1]。該病毒全長 2 000 bp，包含3個主要的開放閱讀框(opening reading frame,ORF)，分別是編碼296個氨基酸組成的復制蛋白酶(replicase protein,Rep)的ORF1、編碼214個氨基酸組成的衣殼蛋白(capsid protein,Cap)的ORF2和編碼230個氨基酸組成的功能未知蛋白的ORF3[2]。

2016年，美國學者PALINSKI等[2]和PHAN等[3]從罹患心肌炎和多系統(tǒng)炎癥的仔豬中發(fā)現(xiàn)PCV3。隨后,在歐洲和亞洲各國的豬群中也相繼發(fā)現(xiàn)了PCV3的存在[2-8]，并且可分為PCV3a和PCV3b等2個亞型[9-10]，這說明PCV3在世界范圍內(nèi)廣泛存在。臨床資料顯示，PCV3可通過胎盤和精液進行傳播[3,10]，不同年齡、性別和品種的豬群均可感染PCV3，但以妊娠母豬和仔豬最為易感[3,5]，主要表現(xiàn)為豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、母豬繁殖障礙(reprdouctive failure sows)和仔豬腹瀉(piglet diarrhea)等問題[2-3,11]。研究發(fā)現(xiàn)，可從犬群中檢測到PCV3[12]，這暗示著PCV3可能和PCV2同樣具有跨物種傳播的能力[13]。

為進一步確認PCV3能感染犬，并了解廣西地區(qū)犬源PCV3毒株的流行情況及其分子特征、分析不同宿主及國內(nèi)外PCV3毒株進化關系，本試驗擬對廣西多個地區(qū)采集的犬血清進行檢測，以期為進一步開展PCV3病毒遺傳進化、致病性研究以及跨種傳播奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料由廣西動物疫病預防控制中心采集并保存來源于廣西防城港、玉林和百色3個地區(qū)的養(yǎng)殖場中的犬或散養(yǎng)家犬的血清，共計148份。

1.2 主要菌株、試劑和載體2×Taq PCR MasterMix、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、Maker Ⅲ、DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化有限公司；Trans5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、酵母粉購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD-18T Simple Vector購自大連寶生物公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 病毒基因組提取根據(jù)天根的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒的方法，提取犬血清DNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒檢測和全基因組擴增根據(jù)GenBank中GX-920/2017(GenBank：MG253683.1)毒株序列，設計合成1對檢測引物(JC-F/R)和2對擴增全長引物(PCV3-F/R)(表1)。引物均由生工生物工程股份有限公司公司合成。

1.4.125 μL檢測反應體系及反應條件 反應體系如下：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，JC-F和JC-R各0.5 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 10.0 μL。反應條件為95℃預變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共30循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.250 μL全長反應體系及反應條件 反應體系如下：2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL，PCV3-F和PCV3-R各1 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 20.0 μL。反應條件為95℃預變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火50 s，72℃延伸2 min，共30循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCV3 檢測和全長引物

1.5 目的片段膠回收、克隆鑒定和測序使用DNA純化回收試劑盒回收擴增的目的片段。將回收純化后的DNA片段與pMD18-T Simple Vector連接并轉化至Trans5α感受態(tài)細胞中。將轉化菌液均勻涂布含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)12 h，挑取單個白色菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、220 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)的菌液按天根質(zhì)粒小提試劑盒方法提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定。將鑒定結果為陽性的質(zhì)粒送吉林庫美生物有限公司測序。

1.6 序列分析應用DNAstar軟件將獲得的基因序列與NCBI公布的代表參考毒株 進行氨基酸序列和核苷酸序列比對。

1.7 系統(tǒng)進化分析利用MEGA7.0軟件，使用Maximum Likelihood (ML) 法p-distance模式構建系統(tǒng)進化樹，并進行基因分型。

2 結果

2.1 分子流行病學調(diào)查利用JC-F/JC-R引物對148份犬血清進行PCR擴增，目的片段為650 bp，發(fā)現(xiàn)其中36份為PCV3陽性樣品，陽性率為24.3%，部分樣品檢測結果如下圖所示(圖1)。

圖1 部分PCR檢測結果 M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對照;2.陰性對照;3～17.臨床樣品

2.2 基于基因組的序列分析選取1份陽性樣品DNA經(jīng)PCV3-1F/R和PCV3-2F/R等2對引物分別進行PCR擴增，目的片段分別為1 300 bp和1 100 bp(圖2)。并對獲得的目的片段進行回收，克隆和測序。利用DNAstar軟件進行拼接。結果顯示目的片段核苷酸序列長度為2 000 bp，將該毒株命名為PCV3/Guangxi-5 (GenBank：MH916639.1)。將PCV3/Guangxi-5 序列與NCBI公布的PCV3的參考序列進行同源性比對，結果顯示Guangxi-5與參考序列的全基因序列同源性為98.9%～100.0%，其中PCV3/Guangxi-5與DE27.16(GenBank：MG014370.1)株同源性最低，與PCV3/CN/Chongqing-148/2016(GenBank：KY075991.1))同源性最高(圖3)。此外對ORF2基因的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，第24至第27位氨基酸有6種形式，分別為VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

2.3.1基于ORF2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 基于ORF2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4A)，結果表明本試驗獲得的PCV3/Guangxi-5(GenBank：MH916639.1)為PCV3a亞型，與PCV3/CN/Liaoning-23/2016(GenBank：KY354060.1)親緣關系最近。此外，本試驗獲得的犬源PCV3/Guangxi-5與NCBI公布的犬源CCV-A、CCV-B、CCV-C毒株不在同一基因亞型，這暗示PCV3毒株可能沒有明顯的物種差異。

2.3.2基于全基因組的系統(tǒng)進化分析 同樣使用Maximum Likelihood (ML) 法p-distance模式構建基于全基因組序列的系統(tǒng)進化樹(圖4B)，結果顯示本試驗獲得的PCV3毒株基因型為PCV3a，且與CN/chongqing-148/2016(GenBank：KY075991.1)親緣關系較近，與CNFJ-1(GenBank：KY753912.1)等毒株親緣性較遠。

圖2 目的片段PCR擴結果 M.DL2000 DNA Marker;1.PCV3-1F/R產(chǎn)物;2.PCV3-2F/R產(chǎn)物

圖3 PCV3全基因組序列分析

3 討論

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種環(huán)狀、單鏈和無包膜的DNA病毒，是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的重要成員之一[14]。該病毒在2016年前被認為只存在2個基因型，即PCV1和PCV2[15-16]，其中PCV1被認為對動物沒有致病性；PCV2則被認為與多種臨床疾病相關。PCV2可引起患豬淋巴細胞和組織細胞凋亡[17]，出現(xiàn)免疫抑制問題[14]。雖然單獨感染PCV2的臨床癥狀輕微，但是當與其他病毒混合感染時，有利于其他病毒的感染和增殖，如與PRRSV、PRV、PPV等病毒混合感染出現(xiàn)PMWS癥狀[14]。此外在跨物種傳播方面，PCV2已被證實可感染牛、羊和犬[18],具有跨種傳播能力[19]。

圖4 基于PCV3 ORF2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2016年美國學者從患病母豬和仔豬的體內(nèi)檢測到一種新型圓環(huán)病毒——豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[2-3]。自PCV3被正式報道以來，在歐洲和亞洲各國和地區(qū)也相繼報道了PCV3感染的情況[4-8]，這表明PCV3在世界范圍內(nèi)廣泛存在。對PCV3基因組研究發(fā)現(xiàn)PCV3具有和PCV1和PCV2相似的基因結構，均存在ORF1和ORF2等2個開放閱讀框，2個閱讀框分別編碼ORF1(Rep)蛋白和ORF2(Cap)蛋白[2]。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)PCV3與PCV2的Cap蛋白氨基酸序列同源性僅為30%[11]，推測PCV2和PCV3相互之間不具有交叉保護的特性。但在跨物種傳播方面，近期的一項研究令人十分驚訝。ZHANG等[12]從犬群中檢測到PCV3，推測PCV3可能與PCV2類似，具備的跨種傳播能力。

本試驗對ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸進行比對分析發(fā)現(xiàn)，Cap蛋白的氨基酸位點突變主要集中在第24位至第27位氨基酸上，且有6種形式(VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK)。據(jù)報道，PCV2的ORF2編碼的Cap發(fā)生變異可能導致新的變異毒株出現(xiàn)，雖然PCV3和PCV2的Cap蛋白同源性較低，但考慮Cap蛋白作為PCV主要結構蛋白，可誘導動物機體產(chǎn)生特異性免疫應答[20-23]，由此推測PCV3毒株的變異與其Cap蛋白氨基酸突變也可能存在一定關聯(lián)。

結合氨基酸序列和系統(tǒng)進化樹進行分析，發(fā)現(xiàn)第24至27位氨基酸序列為LRRK和VRRK的PCV3毒株主要集中在PCV3a中，氨基酸序列為ARRR，VRRR,ARKR,VRRR和一小部分VRRK的毒株集中在PCV3b，推測Cap蛋白的第24位至27位氨基酸的形式與基因型之間可能存在一定聯(lián)系。此外，分析發(fā)現(xiàn)犬源PCV3毒株之間的同源性并不是最高的，且PCV3/Guangxi-5與CCV-A、CCV-B、CCV-C處不同基因亞型，這暗示PCV3毒株可能沒有明顯的物種差異。

綜上所述，本試驗從犬血清樣品中檢測到PCV3的基因組，證實了廣西地區(qū)的犬群中已經(jīng)存在PCV3感染的情況，并完成1株犬源PCV3的全基因序列測定，理論上豐富了廣西地區(qū)PCV3的流行病學資料，為PCV3的防治措施的制定和流行病學研究提供一定的參考依據(jù)。