汪祥斌，賈 坤，賈榮榮，李守軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

牛流行熱(bovine ephemeral fever,BEF)是由牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)感染導(dǎo)致的急性傳染病，主要由蚊子、庫蠓等傳播。牛是唯一的易感動(dòng)物，病牛的特點(diǎn)是突然高熱(雙相熱，常達(dá)到40℃以上)、肢體僵硬、皮下氣腫、流涎、眼鼻分泌物增多、厭食、跛行等[1-2]。該病的特點(diǎn)是發(fā)病迅速，恢復(fù)也快(一般3 d可恢復(fù))，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致牛死亡，目前對(duì)死亡的直接原因還知之甚少。由于感染后可導(dǎo)致牛產(chǎn)奶、耕作、生殖等能力的下降，給養(yǎng)牛業(yè)帶來的損失相當(dāng)巨大。目前，牛流行熱主要發(fā)生于非洲、亞洲、澳大利亞的亞熱帶和溫帶地區(qū)，在中國南方和東南的很多區(qū)域都有發(fā)生和流行[3]。該病使奶牛產(chǎn)奶量降低，乳品質(zhì)下降，牛跛行以及癱瘓，給養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。

牛流行熱病毒是負(fù)義單鏈RNA病毒，呈典型的子彈狀，病毒顆粒為75～185 nm，有些病毒顆粒呈現(xiàn)錐型，病毒的全長約為14 900 nt。其中已確定11組基因，順序依次為3′-N-M1-M2-G-GNS-α1-α2-α3-β-γ-L-5′[4]。牛流行熱G蛋白是牛流行熱病毒中和抗體的靶蛋白，其與同科病毒具有結(jié)構(gòu)的同源性。研究者用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)4種G蛋白的表明抗原，分別稱為G1～G4，目前只發(fā)現(xiàn)G1位點(diǎn)只和BEFV陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)，其余都與同科病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)[5-6]。到目前為止，國內(nèi)外研究者已經(jīng)建立多種BEFV抗體檢測(cè)及快速檢測(cè)方法[7-10]，TaqMan探針法實(shí)時(shí)定量PCR優(yōu)點(diǎn)顯著可快速、精確檢測(cè)病毒，適合于病毒的快速分析檢測(cè)。本試驗(yàn)在BEFV G基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)探針和引物，建立了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，并運(yùn)用該方法對(duì)臨床收集的109份?？鼓獦悠愤M(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及檢測(cè)樣品已鑒定患有牛流行熱病毒?？鼓?、藍(lán)舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(ABV)及臨床采集的109份?？鼓蓮V東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑DNA純化回收試劑盒(離心柱型)、DH5α購自天根生化科技公司；RNA提取試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、Phanta?高保真酶購自南京諾唯贊公司；LightCycle?Probes Master購自聚研生物公司；pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit試劑盒購自北京全式金公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)從GenBank搜索BEFV G蛋白不同的基因序列并下載，運(yùn)用MegAlign軟件對(duì)序列分析，選取其保守區(qū)設(shè)計(jì)上、下游引物及探針，序列為：qPCR-1193-F:5′-TCATTGATAAGAATGAAGATGGC-3′,qPCR-1328-F:5′-TGGTTCCACAAAGATCATTC-3′,P:(FAM)5′-AGCTTCCTCCTGCTGGTGC-3′(BQ1),序列均由英濰捷基公司合成。

1.4 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄將?？鼓蛛x出白細(xì)胞層，按照RNA提取試劑盒里說明書的步驟操作得到總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR反應(yīng)體系為：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 14 μL，cDNA 5 μL，總體積為50 μL。經(jīng)過凝膠電泳后將產(chǎn)物回收并克隆于pEASY?-Blunt載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pEASY-BEFV，送華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用微量分光光度計(jì)得出質(zhì)粒濃度，并換算為拷貝數(shù)。

1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化將pEASY-BEFV作為檢測(cè)模板，控制單一變量，摸索探針和引物的最佳使用濃度。

1.7 敏感性試驗(yàn)及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線10倍梯度稀釋pEASY-BEFV，對(duì)不同濃度的質(zhì)粒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及確定該方法能夠檢測(cè)的最低拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的x軸為稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)，y軸為測(cè)出的Cp值。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)運(yùn)用該方法，選取1010～104拷貝/μL的樣品，在同一板和不同板上分別進(jìn)行3次的重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算批內(nèi)、批間重復(fù)的變異系數(shù)的平均值。

1.9 臨床樣品檢測(cè)使用該方法對(duì)廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集的109份?？鼓M(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備將cDNA按要求配好反應(yīng)體系，通過PCR儀反應(yīng)，經(jīng)凝膠電泳后，結(jié)果在100～250 bp附近有明亮條帶，符合預(yù)期結(jié)果(圖1)。切下符合大小膠塊，經(jīng)試劑盒回收后與pEASY?-Blunt載體相連，并將質(zhì)粒命名為pEASY-BEFV。經(jīng)PCR檢測(cè)及公司測(cè)序分析，其結(jié)果符合預(yù)期。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，使用微量分光光度計(jì)得到質(zhì)粒質(zhì)量濃度為226.9 mg/L，即拷貝數(shù)為1.33×1012拷貝/μL。使用雙蒸水進(jìn)行10倍梯度稀釋，并儲(chǔ)存于-20℃冰箱。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR方法的建立運(yùn)用控制單一變量的方法對(duì)引物、探針進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最優(yōu)的反應(yīng)條件，反應(yīng)體系為： LightCycle?480 Probes Master(2×conc) 10 μL，10 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL，0.5 μL探針，ddH2O 5.5 μL，模板2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min； 95℃ 20 s，53℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，53℃收集熒光。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)已稀釋好的pEASY-BEFV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該標(biāo)準(zhǔn)曲線在1010～105拷貝/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好(R2=0.998)(圖2，3)。其可檢測(cè)到101拷貝/μL，表明該方法較敏感。

圖1 目的基因擴(kuò)增 1．目的基因;M.DL2000 DNA Marker

圖2 BEFV實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

圖3 BEFV實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果采用RNA提取試劑盒提取的藍(lán)舌病病毒、赤羽病病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以pEASY-BEFV為陽性對(duì)照，測(cè)試該方法的特異性。結(jié)果顯示，除質(zhì)粒外，其余樣品檢測(cè)都為陰性，表明該方法特異性良好(圖4)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用最優(yōu)方法對(duì)選取的樣品進(jìn)行3次批內(nèi)和3次批間重復(fù)qPCR試驗(yàn)，得到2種試驗(yàn)變異系數(shù)都較低(<3%)，說明重復(fù)和穩(wěn)定性較好(表1)。

圖4 BEFV實(shí)時(shí)定量PCR特異性檢測(cè)結(jié)果 1.pEASY-BEFV;2.BTV;3.ATV;4.陰性對(duì)照

2.6 臨床樣品檢測(cè)使用優(yōu)化好的反應(yīng)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的109份?？鼓獧z測(cè)。其中檢出8份陽性樣品，陽性率為7%，表明可用于臨床的初步檢測(cè)。

表1 BEFV實(shí)時(shí)定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

隨著牛場(chǎng)對(duì)本病重視程度的提高，本病零星散發(fā)或呈地方流行發(fā)生是近期我國的流行方式[11-12]，在中國南方，由于氣候原因，本病可從春季開始散發(fā)，一直可持續(xù)到冬季，乳品質(zhì)下降和死淘率上升等問題給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗目前仍然是最為有效的保護(hù)措施[13]，本病可通過阻斷性治療來治愈，有研究表明，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)可以有效抑制牛流行熱病毒的增值[14]。發(fā)病時(shí)可用抗炎藥物治療疾病發(fā)展過程中的炎癥，早期治療效果更好[15]。所以，對(duì)于BEFV的早期檢測(cè)顯得尤為重要。

TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR的優(yōu)點(diǎn)眾多，該方法快速便捷，檢測(cè)結(jié)果精確，已被很多研究者運(yùn)用于臨床檢測(cè)。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫上不同BEFV的 G基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，在保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物和探針，建立檢測(cè)BEFV 的TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR方法。該重復(fù)性試驗(yàn)得到的平均變異系數(shù)結(jié)果較好(<3%)；檢測(cè)下限達(dá)到1×101拷貝/μL。運(yùn)用該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.998,。該方法與牛藍(lán)舌病毒、牛赤羽病毒無交叉反應(yīng)，能特異檢測(cè)BEFV并具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的109份牛抗凝血樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽性率為7%，表明本方法可用于BEFV的臨床檢測(cè)，為有效防控BEFV提供技術(shù)支撐。