張世亨，黃海鑫，尹彥文，施開創(chuàng)，鄭 敏，汪 偉,4，曹 亮，孫文超，魯會軍 *，金寧一*

(1.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 325035； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春，130118； 3.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；4.軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122)

豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種致病性腸道冠狀病毒，該病毒主要經(jīng)消化道感染，進(jìn)而侵害豬的小腸，特別是空腸與回腸，發(fā)病突然，傳播迅速[1]。PDCoV可引起5～15日齡的哺乳仔豬發(fā)生腹瀉和嘔吐、迅速脫水、衰竭而死亡，死亡率高達(dá) 50%～80%[2]。與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)比較，PDCoV感染引起的仔豬表現(xiàn)出腹瀉癥狀輕微和死亡率低[3-4]。

PDCoV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，該病毒屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒亞科(Coronavirinae)，德爾塔冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)成員，基因結(jié)構(gòu)與PEDV相似，約為25.4 kb[5]。PDCoV基因結(jié)構(gòu)包含5′和3′非翻譯區(qū)及至少7個(gè)開放性閱讀框，分別編碼多聚酶蛋白 (polymerase protein)1a/1b、纖突(spike，S)蛋白、小膜(envelope，E)蛋白、膜(Membrane，M)蛋白、核衣殼(Nucleocapsid，N)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白6(nonstructural protein 6，NS6)及非結(jié)構(gòu)蛋白7(nonstructuralprotein 7，NS7)[6]。其中,S蛋白在PDCoV與受體的識別、結(jié)合、融合和侵入宿主細(xì)胞等方面起到重要的作用；并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對該病原的中和抗體[7-9]。

該病毒于2012年在中國香港被首次報(bào)道，隨后該病原在美國、韓國、中國、泰國也相繼被報(bào)道[5,10-11]。本試驗(yàn)從中國廣西地區(qū)PDCoV陽性樣品中擴(kuò)增1株P(guān)DCoV的全基因組序列，分析其進(jìn)化關(guān)系及其核苷酸同源性，為下一步的PDCoV病毒的致病基因及遺傳進(jìn)化的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2018年由廣西壯族自治區(qū)動物疾控中心采集發(fā)病仔豬腹瀉小腸內(nèi)容物及糞便，將樣品儲存在-80℃。

1.2 試劑、菌株和載體UNIQ-10柱式Trizol RNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；

2×Vazyme LAmp Master Mix (Dye Plus)購自諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購于NEB有限公司；感受態(tài)細(xì)胞購自天根科技有限公司。

1.3 病料檢測利用針對PDCoV基因的特異性檢測引物F1:5′-ACCAACCAACACCGTCCTTTA -3′和R1:5′-AGAACCACGAGACTGTAAGCA -3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長度1 100 bp。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄的PDCoV CHN-AH-2004株基因序列(登錄號：KP757890.1)，針對全基因分別設(shè)計(jì)25對特異性引物，引物序列見表1。

表1 用于擴(kuò)增PDCoV基因組的引物

續(xù)表1

1.5 PDCoV 全基因克隆及序列分析

1.5.1樣本處理及RNA提取 取PDCoV陽性病料，按照UNIQ-10柱式Trizol RNA提取試劑盒說明書抽提PDCoV陽性病料RNA，將所得RNA溶液放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2PDCoV 全基因克隆鑒定 以提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板1 μL，上、下游引物各2 μL，2×Vazyme LAmp Master Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。RT-PCR反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60～65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.5.3PDCoV重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接，鑒定為陽性的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。將全基因與GenBank PDCoV流行毒株進(jìn)行序列比較分析。

2 結(jié)果

2.1 PDCoV 全基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果利用檢測引物F1/R1臨床病料進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果2018年從廣西各地4個(gè)豬場采集的10份疑似組織病料中檢出PDCoV陽性1份(圖1)。

2.2 PDCoV 全基因的鑒定與測序結(jié)果目的片段與載體連接，對所得質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。選取2018年采集的1份陽性病料，利用25對特異性測序引物分段擴(kuò)增病毒基因?；厥誔CR目的產(chǎn)物，經(jīng)測序和拼接，獲得全長為25 407 bp的病毒全基因組序列，并命名為CHN-GX01-2018，GenBank 登錄號為MK359104。

圖1 豬腹瀉病料PDCoV RT-PCR 檢測結(jié)果 M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陽性對照；2.陰性對照

2.3 PDCoV全基因的序列分析本研究中獲得CHN-GX01-2018全基因全長為25 406 bp?；蚪Y(jié)構(gòu)包含1個(gè)539 bp 5′UTR，ORF1a在第540～11 399 bp 位置，ORF1b在11 399～19 327 bp，S基因大小為3 480 nt(19 309～22 788 bp)，E基因大小為252 bp (22 782～23 033 bp)，M基因大小為654 bp(23 026～23 679 bp)，NS6大小為285 bp(23 679～23 963 bp)，N基因大小為1 029 bp(23 984～25 012 bp)，NS7基因大小為603 bp(24 078～24 680 bp)和3′UTR 大小395 bp。

ORF1a/1b編碼2個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab，主要是與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白酶。本研究發(fā)現(xiàn) CHN-GX01-2018株與美國8734-USA-IA-2014株及部分中國CHN-AH-2004株比較在其第400～402位置存在3個(gè)氨基酸缺失(圖2)，第756～759位置存在4個(gè)氨基酸缺失(圖3)。S基因編碼的S蛋白是存在于 PDCoV表面上最大的蛋白，S蛋白中都存在 Spike 切割位點(diǎn)(RRSRR)，隨后被切割產(chǎn)生2個(gè)的蛋白 S1 和 S2。本研究發(fā)現(xiàn) CHN-GX01-2018株與大部分中國毒株一樣存在第52位氨基酸缺失(圖4)，表明中國毒株與美國流行毒株存在差異，表明該類型毒株已經(jīng)成為中國PDCoV的優(yōu)勢毒株。然而研究發(fā)現(xiàn)CH/jiangsu/2014毒株與美國流行毒株在S基因第52位置保持一致，表明國內(nèi)PDCoV毒株在不同地域可能存在一定的差異性。

2.4 PDCoV全基因組、S和N基因的同源性分析全基因組同源性分析表明，CHN-GX01-2018株與中國國內(nèi)代表毒株安徽CHN-AH-2004株、廣東GD株、湖南CH-Hunan-2014株、山東SD株、江蘇CH-Jiangsu-2014株、四川CH-Sichuan-S27-2012株、河北CHN-HB-2014株核苷酸同源性為98.0%～98.8%；CHN-GX01-2018株與美國8734-USA-IA-2014株同源性為98.2%；與東亞韓國KNU14-04株、日本YMG-JPN-2014株核苷酸同源性為98.0%～98.2%；與東南亞的越南Vietnam-Binh21-2015株、老撾BTL_0115-PDCoV-2016-Lao株、泰國Thailand-S5015L-2015株核苷酸同源性分別為97.7%～98.1%。

在結(jié)構(gòu)蛋白中，PDCoV變異較大，大小為3 480～3 483 個(gè)堿基，并且S蛋白表面具有抗原決定簇，決定病毒毒力，且能與病毒的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞膜的融合，是PDCoV主要的保護(hù)性抗原蛋白，因此成為研究的重點(diǎn)。CHN-GX01-2018株與國內(nèi)代表毒株安徽CHN-AH-2004株、廣東GD株、湖南CH-Hunan-2014株、山東SD株、江蘇CH-Jiangsu-2014株、四川CH-Sichuan-S27-2012株、河北CHN-HB-2014株核苷酸同源性分別為97.4%，97.6%，98.0%，98.2%，97.8%，98.4%和98.2%；CHN-GX01-2018株與國外代表毒株美國8734-USA-IA-2014株、韓國KNU14-04株、日本YMG-JPN-2014株、越南Vietnam-Binh21-2015株、老撾BTL_0115-PDCoV-2016-Lao株、泰國Thailand-S5015L-2015株核苷酸同源性分別為97.9%，97.9%，97.9%，96.4%，96.2%和96.0%。

圖2 PDCoV ORF1a/1b 第400～403位氨基酸分析

圖3 PDCoV ORF1a/1b 第756～759位氨基酸分析

圖4 PDCoV S基因氨基酸分析

在結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白相對保守，并且是PDCoV主要的保護(hù)性抗原蛋白。CHN-GX01-2018株與國內(nèi)代表毒株安徽CHN-AH-2004株、廣東GD株、湖南CH-Hunan-2014株、山東SD株、江蘇CH-Jiangsu-2014株、四川CH-Sichuan-S27-2012株、河北CHN-HB-2014株核苷酸同源性分別為98.0%，98.0%，98.7%，98.2%，98.1%，98.8%和98.8%；CHN-GX01-2018株與國外代表毒株美國8734-USA-IA-2014株、韓國KNU14-04株、日本YMG-JPN-2014株、越南Vietnam-Binh21-2015株、老撾BTL_0115-PDCoV-2016-Lao株、泰國Thailand-S5015L-2015株核苷酸同源性分別為98.5%，98.7%，98.4%，98.5%，97.9%和97.6%。對CHN-GX01-2018株全基因組、S基因和N基因同源性分析表明，當(dāng)前PDCoV流行毒株出現(xiàn)較大的遺傳變異。

2.5 PDCoV 全基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析基于病毒全基因組(圖5)以及S基因(圖6)、N基因(圖7)核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹。全基因組以及S基因進(jìn)化分析表明，東南亞地區(qū)毒株越南Vietnam-Binh21-2015株、老撾BTL_0115-PDCoV-2016-Lao株、泰國Thailand-S5015L-2015株處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系較近。美國8734-USA-IA-2014株、韓國KNU14-04株、日本YMG-JPN-2014株毒株處于同一進(jìn)化分支。而CHN-GX01-2018株與四川CH-Sichuan-S27-2012株同源關(guān)系較近。研究發(fā)現(xiàn)中國PDCoV毒株的安徽CHN-AH-2004株、廣東GD株、湖南CH-Hunan-2014株、山東SD株、江蘇CH-Jiangsu-2014株、四川CH-Sichuan-S27-2012株、河北CHN-HB-2014株等參考毒株處于不同進(jìn)化分支，推測它們可能有不同的來源，也提示我們當(dāng)前中國PDCoV毒株正處于不斷進(jìn)化狀態(tài)。N基因與S基因核苷酸序列進(jìn)化樹呈現(xiàn)不一致性，提示PDCoV不同結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)化速率也呈現(xiàn)不一致性。

圖5 PDCoV全長進(jìn)化分析

圖6 PDCoV S基因遺傳進(jìn)化分析

圖7 PDCoV N基因遺傳進(jìn)化分析

3 討論

2012年在中國香港首次發(fā)現(xiàn)PDCoV，直到2014年在美國腹瀉仔豬中首次成功分離，并證明其致病性[4]。2014年至今，中國大陸對 PDCoV 流行報(bào)道日趨增多，國內(nèi)多所大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)開展PDCoV的研究。DONG等[2]2013-2014年首次證實(shí)PDCoV 在中國豬場中存在，陽性率為14.3%。

JANETANAKIT等[12]報(bào)道，在泰國東部省份養(yǎng)豬場暴發(fā)母豬急性水樣腹瀉，食欲不振和無乳癥，仔豬發(fā)熱、水樣腹瀉和嚴(yán)重的脫水，母豬死亡率為27.63%(829/3 000)，仔豬占64.27%(2 892/4 500)。腹瀉樣品經(jīng)檢測為PDCoV感染，2株P(guān)DCoV的序列與中國安徽株同源性98.43%。SUZUKI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，日本PDCoV毒株全基因組與美國、韓國毒株同源性為99.7%～100%，與中國毒株(包括香港毒株)同源性為98.6%～99.3%，與泰國、越南和老撾毒株同源性為97.4%～97.8%。

針對PDCoV病原學(xué)、流行病學(xué)、致病性、培養(yǎng)與檢測等陸續(xù)研究已經(jīng)展開。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肖少波團(tuán)隊(duì)等開展PDCoV病毒分離、致病性、受體等研究工作，證實(shí)在5日齡和21日齡仔豬中證實(shí)CHN-HN-2014的致病性，分別研究NS6、Nsp5在病毒復(fù)制及與宿主相互作用[14-16]。據(jù)報(bào)道，在開展PDCoV NH 株的分離及其致病性的研究中發(fā)現(xiàn)pAPN受體在病毒感染中的作用[17-18]。據(jù)報(bào)道，PDCoV受體及開展病毒致病機(jī)制試驗(yàn)，證實(shí)PDCoV侵染LLC-PK1細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[19]。

S蛋白的變異會導(dǎo)致PDCoV毒力、組織細(xì)胞的培養(yǎng)及宿主范圍發(fā)生改變。然而目前對S蛋白氨基酸缺失對PDCoV毒力改變，是否會造成強(qiáng)弱毒株的改變目前還沒有定論。S基因常被作為PDCoV變異的標(biāo)志，揭示PDCoV病毒進(jìn)化的特征，本研究通過對地方流行株的S基因進(jìn)行序列分析，可及時(shí)了解當(dāng)?shù)亓餍兄甑淖兓厔荨Ｍ葱苑治霰砻?，CHN-GX01-2018株S基因序列與所有PDCoV毒株核苷酸同源性>96%。遺傳進(jìn)化分析表明，CHN-GX01-2018株與四川CH-Sichuan-S27-2012株，同源性較近，可能存在從同一祖先進(jìn)化而來。CHN-GX01-2018株S、N基因的遺傳進(jìn)化分析不一致，表明PDCoV各結(jié)構(gòu)基因進(jìn)化速率存在不一致性。

總之，我們的研究結(jié)果豐富了PDCoV在中國的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。PDCoV作為一種新出現(xiàn)的冠狀病毒，其在中國及世界各地的爆發(fā)頻率日漸增加。然而，PDCoV的流行病學(xué)和病毒演化規(guī)律、發(fā)病機(jī)制，對公共衛(wèi)生健康的影響等仍然知之甚少，有必要加強(qiáng)中國豬群的流行病學(xué)調(diào)查，并探索其致病機(jī)理。