張 宇，劉 芳，田潤博，鄭慧華，趙 宇，徐朋麗，韓昊瑩，張鴻鑫，崔建濤，陳紅英

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)，即奧耶茲病(Aujeszky’s disease)，是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起牛、羊、豬等多種家畜及野生動物的一種急性傳染病[1-2]。豬是PRV的天然宿主和最主要的傳染源，各年齡階段的豬均可被PRV流行株感染，且成年豬的隱性感染引發(fā)長期帶毒、排毒現(xiàn)象，給PR的防制和根除帶來了巨大的困難[3]。目前,對PR進(jìn)行防控主要依靠疫苗接種免疫[4]。20世紀(jì)90年代，我國豬場普遍用從匈牙利引進(jìn)了PRV Bartha-K61株制備的該疫苗進(jìn)行防疫[5-6]，使該病在我國得到了有效地控制。

自2011年底，我國許多規(guī)模化豬場免疫過PR疫苗的豬群中出現(xiàn)PR疫情的大流行[7-8]。許多學(xué)者已從免疫過PR疫苗的死亡仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到PRV，并對其進(jìn)行測序與比對。結(jié)果顯示，PRV流行株處于一個相對獨(dú)立分支，與以往國內(nèi)外的PRV分離株及Bartha-K61等常用疫苗株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，且對仔豬的致病性更強(qiáng)[4,9]。PRV流行株的抗原性已經(jīng)發(fā)生了變異，Bartha-K61等常用疫苗株已不能完全保護(hù)PRV流行變異株的感染[9-11]。

TK基因是PRV最主要的毒力基因，許多未缺失TK基因的弱毒疫苗，使用中可能存在毒力返強(qiáng)的可能性，還可能會引起潛伏感染的危險[12]。此外，缺失TK基因不僅可明顯降低PRV的侵染力、傳播力和毒力，且仍能使PRV保持良好的免疫原性。因此，考慮到弱毒株的安全性問題，本試驗(yàn)在PRVgE/gI雙基因缺失毒株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行TK基因的缺失以期望將其用于防控當(dāng)前PRV變異毒株的疫情中，為我國根除PR創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞和試驗(yàn)動物PRV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pG由鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，其中(PstⅠ-PstⅠ)部分含有完整的綠色熒光蛋白基因(EGFP)表達(dá)盒，包括CMV、EGFP、MCS、SV40 PolyA尾基因片段，大小為1 672 bp；載體pMD 18-T和pUC19購自寶生物工程(大連)有限公司。PRV變異株gEgI雙基因缺失突變株rPRV NY-gE-/gI-由鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，以2012年分離的PRV NY變異株為親本株，缺失其gE/gI雙基因而構(gòu)建；豬睪丸(ST)細(xì)胞購自中國獸藥監(jiān)察所；豬偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；6周齡小白鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要試劑2×Taq Master Mix酶和DNA凝膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)生物技術(shù)有限公司；EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、XfectTMTransfection Reagent購自寶生物工程(大連)有限公司；UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；OMEGA E.Z.N.A.TMEndo-Free Plasmid Mini KitⅠD6948-01B購自O(shè)MEGA公司；DMEM購自武漢博士德生物公司；2×DMEM、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自索萊寶科技有限公司。

1.3 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)路線圖見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.4 左右同源臂的引物設(shè)計與合成參考PRV TJ株UL區(qū)基因序列(GenBank登錄號：KJ789182)，設(shè)計2對特異性引物，分別用于左右同源臂的擴(kuò)增，其中左同源臂包括部分UL24基因和部分TK基因；右同源包括部分TK基因和部分UL22基因，下劃線部分為上下游引物5′端的酶切位點(diǎn)(表1)。針對左右同源臂，設(shè)計了1對特異性引物TKQS/F和TKQS/R，用于TK基因缺失部分的PCR鑒定。此外，設(shè)計1對特異引物gB/F和gB/R，擴(kuò)增gB全基因，用于鑒定重組病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 同源臂擴(kuò)增所需引物信息

注：F表示上游引物，R表示下游引物

1.5 左右同源臂的克隆用UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒提取PRV NY株DNA。利用2對特異性引物TKL/F和TKL/R、TKR/F和TKR/R，分別擴(kuò)增TK基因缺失部分兩側(cè)的序列，作為左右同源臂。分別將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆到載體pMD18-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-TKL和pMD-TKR并進(jìn)行測序，所測的序列通過NCBI Blast進(jìn)行比對，以確定左右同源臂序列的正確性。

1.6 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-TKLRE的構(gòu)建與鑒定用Q.Cut HindⅢ和Q.Cut PstⅠ對重組質(zhì)粒pMD-TK進(jìn)行酶切，回收純化目的片段亞克隆到同樣處理的載體pUC19中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-TKL。用Q.Cut EcoRⅠ和Q.Cut PstⅠ對重組質(zhì)粒pMD-TKR進(jìn)行酶切，回收純化目的片段亞克隆到同樣處理的質(zhì)粒pUC-TKL中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-TKLR。用HindⅢ、PstⅠ對重組質(zhì)粒pUC-gE/gILR進(jìn)行酶切鑒定。

用Q.CutPstⅠ酶切質(zhì)粒pG釋放出EGFP基因表達(dá)盒，回收純化目的片段克隆到同樣處理的質(zhì)粒pUC-TKLR中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-TKLRE。用PstⅠ對重組質(zhì)粒pUC-TKLRE進(jìn)行酶切鑒定后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+三基因缺失株的構(gòu)建

1.7.1轉(zhuǎn)染 當(dāng)ST細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時，參照XfectTMTransfection Reagent試劑說明書將rPRV NY-gE-/gI-株DNA與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-TKLRE進(jìn)行共轉(zhuǎn)染到ST細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后約4 h時，移除轉(zhuǎn)染液，換為2 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，反復(fù)凍融3次收取病毒液，3 000 r/min離心5 min。取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2重組病毒的空斑純化與鑒定 當(dāng)ST細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，將10-2～10-7稀釋度的上述病毒液分別接種到六孔板中，并用低熔點(diǎn)營養(yǎng)瓊脂鋪板，進(jìn)行重組病毒的蝕斑篩選。挑選在熒光顯微鏡藍(lán)光下觀察到最大綠色熒光蝕斑，反復(fù)凍融3次，進(jìn)行下一輪蝕斑的篩選，直至在藍(lán)光條件下觀察到的所有病毒蝕斑均可呈現(xiàn)綠色熒光。將拯救得到的病毒命名為rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。利用特異性引物TKQS/F和TKQS/R，對重組病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 5 min；95℃ 50 s；59℃ 45 s；72℃ 150 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃ 10 min。將回收純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，驗(yàn)證TK基因上缺失的序列。再用gB全基因特異引物gB/F和gB/R，對rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+進(jìn)行g(shù)B基因的擴(kuò)增。

1.8 重組病毒的生長特性將rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+、rPRV NY-gE-/gI-、弱毒疫苗Bartha-K61株以及親本病毒PRV NY株分別以10 μL(106.0TCID50/0.1 mL)劑量接種單層ST細(xì)胞的24孔板中。接種病毒4 h后，開始每隔2 h收取細(xì)胞及其上清培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，進(jìn)行TCID50值的測定。根據(jù)結(jié)果繪制出病毒的一步生長曲線，并進(jìn)行分析。

1.9 小鼠安全性試驗(yàn)將40只生長健康的6周齡SPF雌性小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，試驗(yàn)具體分組和接種情況見表2，接種途徑為背部皮下分點(diǎn)注射。接種后，每天觀察并記錄小鼠臨床反應(yīng)情況。

表2 試驗(yàn)鼠分組及免疫情況

2 結(jié)果

2.1 左右同源臂的克隆結(jié)果用2對特異性引物TKL/F和TKL/R、TKR/F和TKR/R，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳。結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出了1條約1 000 bp 的片段(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相吻合。測序結(jié)果顯示，左、右同源臂片段大小分別為967 bp和976 bp。NCBI Blast比對結(jié)果顯示，左、右同源臂與PRV TJ株UL區(qū)基因同源性均高達(dá)99.9%，表明成功獲得同源臂序列。

圖2 同源臂的擴(kuò)增 M.DL2000 DNA Marker；1.左同源臂(TKL)；2.右同源臂(TKR)；3.陰性對照

2.2 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的酶切鑒定重組質(zhì)粒pUC-TKLR經(jīng)HindⅢ、PstⅠ酶切后，電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)了2條帶，1條為插入的左同源臂，位置約為1 000 bp；另外1條為右同源臂與pUC-19載體通過EcoRⅠ位點(diǎn)相連的片段，約為3 700 bp(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-TKLRE經(jīng)PstⅠ進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)了2條帶，一條為插入的含EGFP基因的(PstⅠ-PstⅠ)酶切片段，約為1 700 bp；另外一條帶，包括左、右同源臂和pUC-19載體，約為5 200 bp(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相一致。

圖3 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的酶切鑒定圖 M.DL5000 DNA Marker；1.pUC-TKLR的HindⅢ/PstⅠ酶切產(chǎn)物；2.pUC-TKLRE的PstⅠ酶切產(chǎn)物

2.3 rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+的拯救與PCR鑒定將rPRV NY-gE-/gI-基因組與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-TKLRE進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，48 h后收獲病毒液。用10倍稀釋法進(jìn)行蝕斑篩選。每次純化時，挑取最大稀釋倍數(shù)孔中的最大綠色熒光蝕斑(圖4)，經(jīng)4輪蝕斑純化，所有病毒蝕斑均表達(dá)綠色熒光。表明重組病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+已純化完全。

以rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+和rPRV NY-gE-/gI-株DNA為模板，利用特異性引物TKQS/F和TKQS/R，對左右同源臂間的缺失部分進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+株DNA擴(kuò)增出了1條約2 100 bp的片段(包括 414 bp和1672 bp EGFP基因表達(dá)盒，圖5泳道2)，未缺失TK基因的rPRV NY-gE-/gI-株DNA擴(kuò)增出了1條約725 bp的片段(包括414 bp和311 bp，圖5泳道1)，與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，獲得的三基因缺失株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+在TK基因上缺失了311 bp，并在缺失部位插入了含EGFP基因的PstⅠ-PstⅠ片段(1 672 bp)。

利用gB全基因特異引物，對重組病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出了1條約3 000 bp的片段(圖6)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖4 不同光照下觀察到的蝕斑照片 A.常光下rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+形成的蝕斑； B.藍(lán)光下rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+形成的蝕斑

圖5 TK缺失部分PCR鑒定結(jié)果 M.DL5000 DNA Marker；1.rPRV NY-gE-/gI-的缺失鑒定結(jié)果；2.rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+的缺失鑒定結(jié)果；3.陰性對照

圖6 重組病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+ gB基因的鑒定 M.DL5000 DNA Marker；1、2.rrPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+的gB基因鑒定結(jié)果；3.陰性對照

2.4 重組病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+的生長特性結(jié)果根據(jù)各個時間點(diǎn)的TCID50測定結(jié)果繪制一步生長曲線(圖7)。三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+、雙基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-以及弱毒疫苗Bartha-K61株，與親本病毒PRV NY株具有非常相似的生長動力學(xué)，但體外生長動力學(xué)比親本毒株弱：在感染細(xì)胞后10～14 h時，PRV NY株的增殖速度極快，而三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+、雙基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-和弱毒疫苗Bartha-K61株的增殖速度和病毒滴度都低于親本株。

2.5 小鼠安全性試驗(yàn)對小鼠進(jìn)行接種后，DMEM(A組)、Bartha-K61(B組)和rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+(C組)免疫組小鼠均未出現(xiàn)不良癥狀，全部存活；而rPRV NY-gE-/gI-(D組)免疫組小鼠在接種72 h后陸續(xù)出現(xiàn)精神低沉、發(fā)癢抓撓等典型的PR發(fā)病癥狀，96 h內(nèi)D組小鼠全部死亡。

圖7 缺失病毒和親本毒株的一步生長曲線

3 討論

PRV龐大的基因組中包含許多對其毒力有影響的基因。TK基因是PRV最主要的毒力基因，主要參與病毒在神經(jīng)組織細(xì)胞中的增殖和復(fù)制過程，且對病毒在機(jī)體內(nèi)維持長期的潛伏感染以及潛伏感染期病毒的復(fù)活過程都起到了關(guān)鍵性作用[13]。TK基因的缺失不僅引起PRV毒力喪失或極顯著地降低，同時也能降低其在神經(jīng)組織中的復(fù)制、傳播以及引起腦炎的能力[14]。臨床上，未缺失TK基因的PRV基因缺失疫苗存在毒力返強(qiáng)的可能性，還可能引起潛伏感染的危險，而且引發(fā)非靶動物感染PRV的報道屢見不鮮。KONG等[15]報道，普遍使用的PRV弱毒活疫苗Bartha-K61引起綿羊出現(xiàn)狂躁、神經(jīng)性瘙癢、發(fā)熱等發(fā)病癥狀。XIN等[16]報道，構(gòu)建的雙基因缺失疫苗rPRV TJ-gE-/gI-對靶動物豬是非常安全的，而對羊卻是有毒性的。安全性和免疫性試驗(yàn)證實(shí)，缺失TK基因后獲得的PRV三基因缺失疫苗對小鼠、綿羊和豬均安全且有效。由于我國豬場大多環(huán)境條件惡劣，管理不到位，豬場內(nèi)也常有鼠、狗、貓等動物。如果豬場使用未缺失TK基因的PRV疫苗，則有可能引起非靶動物感染PRV等生物安全隱患。因此，本研究對PRV雙基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-進(jìn)一步進(jìn)行TK基因的缺失。

合適長度的同源臂是保證同源重組順利進(jìn)行的基礎(chǔ)[17]。本試驗(yàn)根據(jù)PRV UL基因序列，設(shè)計2對引物，擴(kuò)增TK基因兩側(cè)序列(作為左右同源臂)，左右同源臂分別為967 bp和 976 bp。PCR擴(kuò)增PRV NY株TK基因兩側(cè)序列，以EGFP基因作為篩選基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-TKLRE。以rPRV NY-gE-/gI-株為親本株，將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUC-TKLRE轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，通過同源重組、綠色熒光蝕斑純化，獲得表達(dá)熒光蛋白的PRV變異株gE/gI/TK三基因缺失突變株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。對重組病毒的PCR鑒定及PCR產(chǎn)物測序證實(shí)，rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+三基因缺失株在TK基因上缺失了311 bp，并在缺失部位插入了含EGFP基因的PstⅠ-PstⅠ片段，表明本試驗(yàn)構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒左右同源臂長度完全可以滿足同源重組的需要。

本試驗(yàn)測定了rPRV NY-gE-/gI-雙基因缺失株、rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+三基因缺失株與親本株P(guān)RV NY以及Bartha-K61弱毒株在ST細(xì)胞上的體外生長曲線，結(jié)果表明4種毒株在ST細(xì)胞上的生長動力學(xué)并沒有明顯差異，但增殖速度和病毒滴度都低于親本株P(guān)RV NY。本試驗(yàn)結(jié)果表明，gE、gI、TK基因作為PRV復(fù)制的非必需基因，雖然缺失后在一定程度上影響了病毒在ST細(xì)胞上的生長速率，但是仍能與親本株一樣在ST細(xì)胞上呈現(xiàn)良好的增殖情況，從而保證了較高的病毒滴度。此外，rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+接種組的小鼠沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，初步證實(shí)該三基因缺失病毒對非靶標(biāo)動物小鼠是安全的；而rPRV NY-gE-/gI-免疫組小鼠全部死亡，說明rPRV NY-gE-/gI-雙基因缺失毒還存在一定的毒力，但還需要對病毒接種劑量進(jìn)行進(jìn)一步地探究。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了PRV三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+，并具有良好的增殖特性，且對非靶標(biāo)動物小鼠是安全的。下一步敲除引入的EGFP標(biāo)記基因，從而獲得不攜帶外源基因的rPRV NY-gE-/gI-/TK-。此外，還將對rPRV NY-gE-/gI-/TK-的遺傳穩(wěn)定性、rPRV NY-gE-/gI-/TK-對靶動物和其他非靶標(biāo)動物的安全性、在妊娠母豬和新生仔豬上的免疫效力以及免疫持續(xù)期等進(jìn)行系統(tǒng)評價，為防控當(dāng)前PRV變異毒株引起的PR疫情，以及構(gòu)建偽狂犬變異株的二價和多價基因工程疫苗提供基礎(chǔ)。