董 波，傅云扉，戴愛玲，李曉華，楊小燕*

(1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,福建 龍巖 364012;2.福建省家畜疫病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室,福建 龍巖 364012)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，對脯乳期仔豬有較強(qiáng)的感染性[1]。PEDV是豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)的致病原，感染仔豬主要臨床表現(xiàn)為消化不良、腹瀉、脫水、嘔吐以及消瘦等，感染率和病死率頗高[2]。當(dāng)前，PEDV已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行，特別是在亞洲、歐洲和美洲國家[3-5]。2013年，一場PEDV疫情席卷美國，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了全球的關(guān)注。PEDV于1984年首次在我國被發(fā)現(xiàn)，因為其高致病性和高死亡率，一直給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來難題和挑戰(zhàn)。2010年末，我國暴發(fā)PEDV，給河北、安徽、廣西、廣東，浙江、江西、四川、湖南、福建等省市的養(yǎng)豬業(yè)帶來不小震動[6]。在本次疫情中，感染仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉、脫水、嘔吐等特征癥狀，死亡率高達(dá)100%。此次疫情造成的損失慘重，甚至之前接種過PEDV疫苗的豬群也同樣發(fā)病，究其原因，可能是由于流行毒株變異或者毒力增強(qiáng)，使現(xiàn)有的疫苗難以提供免疫保護(hù)[7]。除此之外，本次疫情迅速蔓延到世界其他國家。例如，日本、加拿大、墨西哥和哥倫比亞等國家也經(jīng)歷了PEDV的持續(xù)暴發(fā)[8]。據(jù)報道，當(dāng)前世界范圍內(nèi)PEDV的流行毒株是新型PEDV毒株，且毒性極強(qiáng)。

PEDV編碼2個復(fù)制酶多聚蛋白ppla和pplab，1個結(jié)構(gòu)蛋白ORF3和4個結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(spike,S)、膜蛋白(membrane,M)、核殼蛋白(nucleocapsid,N)和小膜蛋白(envelope,E)[9]。自20世紀(jì)90年代以來，定期接種疫苗策略已在福建省養(yǎng)豬場中廣泛實施，然而，免疫接種未能在2010年有效預(yù)防PEDV，表明本次PEDV暴發(fā)毒株的毒性增強(qiáng)，以疫苗毒株CV777作為免疫原生產(chǎn)的疫苗未能提供有效保護(hù)，從而降低免疫接種的有效性。因此，分析當(dāng)前流行毒株的基因特征和遺傳規(guī)律，研發(fā)針對性強(qiáng)的流行毒株疫苗是當(dāng)務(wù)之急。

S基因是PEDV的主要結(jié)構(gòu)基因之一，在誘導(dǎo)病毒進(jìn)入和宿主細(xì)胞融合中起關(guān)鍵作用[10]。同時，有報道指出S基因是揭示PEDV遺傳多樣性最有用的基因，在2010年大規(guī)模暴發(fā)的PEDV也與S基因的遺傳變異有關(guān)[11]。此外，研究表明S基因含有4個中和表位區(qū)域，可以誘導(dǎo)宿主體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體[12]。因此，S基因是分析PEDV進(jìn)化特征、遺傳多樣性以及重組研究的最優(yōu)佳選擇，可以更為清楚地了解PEDV流行病學(xué)參數(shù)從而更好地控制和預(yù)防PEDV。本試驗鑒于S基因在PEDV流行病學(xué)研究中的重要性，收集了2016年1月—2017年12月閩西地區(qū)規(guī)?；i場送檢PEDV陽性病例，采用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增陽性樣品全長S基因，進(jìn)行同源性比較，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，理清閩西地區(qū)PEDV與國內(nèi)外流行毒株以及疫苗毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。本試驗旨在為進(jìn)一步分析我國PEDV的遺傳進(jìn)化提供理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)新型PEDV疫苗提供流行病學(xué)資料，以更有效地預(yù)防PEDV仔豬。

1 材料與方法

1.1 樣品樣品來自2016年1月—2017年12月送往龍巖學(xué)院病毒性腹瀉研究室的6份PEDV陽性病例，6份病例均伴有水性腹瀉、脫水等典型癥狀。待病畜死亡后，收集小腸組織及腸道內(nèi)容物等樣本。

1.2 主要試劑AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、AxyPrep凝膠回收試劑盒，購自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、5×M-MLV Buffer、pMD18-T Vector，購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer，購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；Oligo(dT)18、Murine RNase Inhibitor、T4DNA Ligase、10×Ligase Buffer，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；胰蛋白酶(Tryptone)、酵母(Yeast Extract)，購自O(shè)XOID公司；Ampicillin(100 g/L)、NaCl、瓊脂粉，購自Biowest公司；異丙醇、三羥基甲基氨基甲烷(Tris 堿)、溴化乙錠(EB)、氯仿、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、DEPC水，購自廣東省汕頭市西隴化工股份有限公司。

1.3 病毒總RNA提取和RT-PCR按照試劑盒中提供的操作手冊，自小腸組織及其內(nèi)容物中提取總RNA。取潔凈EP管，加入RNA 11 μL、Oligo(dT)18 1 μL，12 000×g離心40 s，于70℃水浴10 min，加入5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水 6 μL，混勻后，42℃水浴30 min，95℃ 水浴10 min。cDNA于-80℃下保存。以cDNA作為模板，采用文獻(xiàn)[13]中的特異性引物分段擴(kuò)增S基因。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，觀察并記錄結(jié)果。

1.4 克隆和測序采用AxyPrep凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上，將連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行鑒定。陽性克隆體被送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(中國，上海)進(jìn)行測序。

1.5 序列及遺傳進(jìn)化及重組分析6株閩西毒株分別命名為：FJLY1601、FJLY1602、LY201402、FJLY1701、FJLY1702和FJLY1703。使用表1中標(biāo)準(zhǔn)毒株的基因庫登錄號，獲取參考毒株S基因序列。通過DNAMAN分析軟件對基因序列進(jìn)行編輯、比對和分析。使用MEGA5.2構(gòu)建核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。將6株閩西毒株S基因與本試驗引用毒株的S基因核苷酸序列進(jìn)行相似性和重組鑒定。使用遺傳算法(GARD)對重組位點(diǎn)進(jìn)行篩選[15]。使用SimPlot 3.5對潛在重組事件進(jìn)行相似性映射和自助掃描分析[16]。

表1 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析中引用的PEDV毒株

2 結(jié)果

2.1 同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析核苷酸序列同源性分析結(jié)果顯示，閩西毒株之間同源性為96.2%～100.0%，與早前國內(nèi)外毒株同源性較低，與疫苗毒株CV777同源性僅在92.2%～94.1%之間。閩西毒株與當(dāng)前國內(nèi)流行毒株以及美國流行毒株同源性為96.0%～97.3%。遺傳進(jìn)化分析可知，本試驗中32株毒株可分成2大組(G1和G2)。G1包括疫苗毒株CV777、早期經(jīng)典毒株(LZC和 SM98)、細(xì)胞培養(yǎng)毒株(Attenuated DR13)以及早期中國毒株；G2則包括2013年分離的4株美國毒株、 2010年后分離的中國流行毒株以及6株閩西毒株(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，閩西毒株與經(jīng)典毒株CV777、2010年前中國分離毒株的親緣性較遠(yuǎn)，與2010年以后中國分離毒株的親緣性較高，與2013年美國毒株親緣性也較高，說明閩西毒株與目前國內(nèi)以及美國流行毒株可能來自同一祖先。

2.2 序列分析PEDVS基因包含4個可誘導(dǎo)中和抗體的區(qū)域，COE (499～638 aa)、SS2 (748～755 aa)、SS6 (764～771 aa)和2C10 (1 368～1 374 aa)[12]。本試驗中，與疫苗毒株CV777相比，閩西菌株COE中存在8～11個突變(表2，圖2)，這些突變與2010年后我國流行毒株以及2013年美國流行毒株突變位點(diǎn)相同。同時，另外3個表位區(qū)域中，SS2呈現(xiàn)保守性，未發(fā)生突變，而在SS6表位區(qū)中出現(xiàn)1～2突變位點(diǎn)，在2C10表位區(qū)中存在0～1個突變位點(diǎn)(圖2)。

2.3S基因的重組分析使用遺傳算法重組檢測(GARD)對閩西菌株以及其他引用菌株S基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育不一致和重組事件的比對與初步篩選。結(jié)果顯示，突變點(diǎn)來源于主要位于S基因5′端1 000～1 500 bp。通過SimPlotv.3.5.1進(jìn)一步評價核苷酸序列的相似性，發(fā)現(xiàn)福建PEDV閩西毒株與G2組其他毒株核苷酸序列相似性較高(圖1)，可以推斷來自于同一祖先。然而，該區(qū)域與G1組毒株存在差異(圖1，3)。

圖1 S基因系統(tǒng)發(fā)育分析

表2 COE區(qū)域突變位點(diǎn)

3 討論

PEDV是引起仔豬腹瀉的主要致病原之一，近年來，PEDV的感染率已經(jīng)超過了豬輪狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重影響[17]。通過對我國PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，中國流行毒株與早期PEDV毒株結(jié)構(gòu)基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明2010年后中國流行毒株屬于一個新的基因型[18]。本研究發(fā)現(xiàn)閩西毒株與2010年后我國流行毒株遺傳關(guān)系更接近，屬于目前國內(nèi)流行株。同時，本試驗結(jié)果表明，閩西毒株與疫苗毒株CV777以及中國、韓國和歐洲早期分離毒株存在遺傳差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

已有研究表明，PEDVS基因在病毒入侵宿主細(xì)胞以及病毒變異中發(fā)揮著重要的作用，被認(rèn)為是遺傳特征研究中最具參考價值的靶基因[19]。本試驗通過對S基因同源性及遺傳進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)，閩西毒株與目前國內(nèi)外流行毒株之間具有較高的同源性，遺傳關(guān)系更密切，可能由同一祖先進(jìn)化而來。并且，遺傳進(jìn)化分析顯示，閩西FJLY1703毒株與廣東分離毒株GD-01[20]位于同一亞群。同時，與疫苗毒株CV777相比，閩西FJLY1703毒株在中和表位COE區(qū)域中存在8個突變，這也與廣東毒株GD-01突變位點(diǎn)相一致。另外，閩西FJLY1703毒株和廣東毒株GD-01在其他中和表位區(qū)域中，均只存在1個相同突變位點(diǎn)(SS6 Y→S 766aa)。這些結(jié)果提示我們，廣東省與閩西地區(qū)相鄰，動物運(yùn)輸可能是PEDV傳播的危險因素之一，因為在這2個省份之間存在豬只或豬肉產(chǎn)品的流通。

圖2 閩西毒株與CV777毒株S基因中和表位區(qū)域的比較

圖3 閩西毒株潛在重組事件分析

本試驗將閩西毒株S基因序列進(jìn)行比對分析后表明，閩西毒株S基因存在一定的插入和缺失，這些變異基本位于S基因的5′端，這些變化與當(dāng)前國內(nèi)其他流行毒株相似。此外，與CV777中和抗原表位區(qū)域相比，閩西毒株抗原表位COE區(qū)域中存在8～11個突變位點(diǎn)，SS6和2C10中也存在突變位點(diǎn)。有報道推測流行毒株S基因中存在插入或缺失以及抗原表位區(qū)域的位點(diǎn)突變，致使PEDV變異毒株具有更強(qiáng)的致病性和抗原性，最終導(dǎo)致2010年中國PEDV的大爆發(fā)[12,21]。本研究結(jié)果表明，閩西毒株與疫苗毒株CV777在基因水平上存在差異，提示以CV777為免疫原開發(fā)的疫苗對當(dāng)前PEDV的預(yù)防和控制效果并不理想，需要開發(fā)新的針對性疫苗。

據(jù)報道，當(dāng)前國內(nèi)PEDV流行毒株屬于一種重組毒株，而重組事件主要發(fā)生在經(jīng)典毒株和變異毒株的S基因上，即來源于弱毒疫苗株(CV777或DR13)和高致病性變異毒株[18,22]。為了進(jìn)一步研究閩西毒株的進(jìn)化特征和重組關(guān)系，本試驗將閩西毒株S基因進(jìn)行重組分析，結(jié)果表明，閩西毒株S基因5′端1 000～1500 bp處存在斷點(diǎn)，5′端部分區(qū)域并非來自于疫苗毒株CV777以及其他早期PEDV毒株，表明S基因的這一區(qū)域出現(xiàn)了較大的分化。重組分析同時表明，閩西流行毒株與國內(nèi)其他大流行毒株相似，是一種S基因發(fā)生變異的新毒株，可能起源于經(jīng)典毒株和變異毒株之間的基因重組。

綜上所述，閩西毒株S基因相互之間保守性較好，與當(dāng)前國內(nèi)流行毒株之間具有較高的同源性，證明閩西流行毒株屬于2010年后分離的中國流行毒株。同時，本試驗結(jié)果表明，當(dāng)前PEDV流行毒株S基因中存在抗原表位突變，可能導(dǎo)致了疫苗接種失敗。這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)研究與開發(fā)新型PEDV疫苗以及加強(qiáng)PEDV疫苗管理的必要性。