張金勇，張 赫，孫文超，肖朋朋，南福龍,4，韓繼成，解長占，哈 卓，莊忻雨，許 汪，魯會軍*，金寧一*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.軍事科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；3.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 325035；4.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)也被稱為A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A,SVA)，該病毒最早由美國的研究人員從污染的人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6)中分離出來，命名SVV-001[1]。SVV可作為一種溶瘤候選藥物進(jìn)行研發(fā)，SVV-001治療小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer,SCLC)已經(jīng)完成了臨床Ⅰ期研究[2]。

2007年，加拿大首次報(bào)道豬感染SVV，隨后在美國部分豬場檢測到SVV[3]。近年來，SVV在美國、巴西、加拿大、泰國、哥倫比亞、越南等國家小范圍流行[4-8]；我國于2015年在廣東省某豬場首次確診豬群感染SVV，并分離CH-01-2015病毒毒株[9-10]，隨后陸續(xù)在湖北、黑龍江、福建、河南、甘肅等省份檢測并分離出SVV病毒毒株[7,11]；研究人員對我國2016-2018年的部分省份進(jìn)行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，遼寧、山東、云南、湖南、新疆、湖北、廣西、四川、貴州、上海等多個(gè)省份均出現(xiàn)豬群感染SVV[7]。塞尼卡病毒病臨床癥狀與豬口蹄疫、豬水皰病、豬水皰疹病以及水皰性口炎臨床癥狀極為相似；急性主要表現(xiàn)為鼻鏡、口腔、舌、蹄冠部等部位出現(xiàn)皮膚或者黏膜出現(xiàn)水皰，輕者表現(xiàn)為發(fā)熱、嗜睡、厭食等臨床癥狀，臨床癥狀可持續(xù)2～14 d[12-14]；此外，5日齡以內(nèi)新生仔豬對該病毒較為敏感，病死率可達(dá)70%[6,15]。

SVV屬于小RNA病毒科塞尼卡病毒屬的唯一成員；該病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7.3 kb，由5′非編碼區(qū)域(untranslated region,UTR)、1個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)、3′非編碼區(qū)域(untranslated region,UTR)以及poly尾巴組成，構(gòu)成小RNA病毒科L-4-3-4標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)布局[1,16]。其中，SVV的開放閱讀框(長度約2 180個(gè)氨基酸)在自身蛋白酶的作用下可以裂解為前導(dǎo)蛋白L以及P1、P2、P3。P1主要編碼病毒衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，在蛋白酶的作用下進(jìn)一步裂解為VP0、VP3、VP1，成熟的VP0裂解為VP2與VP4；P2與P3編碼與病毒復(fù)制的相關(guān)蛋白，在蛋白酶的作用下依次裂解為2A、2B、2C、3A、3B、3C以及3D[16-17]。SVV的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白較為保守，且含有主要的抗原表位，能夠與宿主細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，其已經(jīng)作為SVV診斷的主要診斷靶抗原進(jìn)行研究。

本試驗(yàn)擬通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并純化SVV VP1與VP3蛋白，為下一步單克隆抗體與多克隆抗體制備、相關(guān)ELISA檢測方法以及基因工程相關(guān)疫苗等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒Trans1-T1、E.coliBL21 (DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶均購自Thermo Scientific公司； IPTG購自Sigma公司；鼠源His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購自碧云天公司；DL2000 DNA Marker、T4DNA連接酶、ExTaq PCR酶均購自TaKaRa公司；Blue Plus Marker、His標(biāo)簽鎳離子蛋白純化柱均購于北京全式金公司；DL5000 DNA Marker購自諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)參照SVV CH-01-2015病毒毒株序列(GenBank登陸號：KT321458.1)及本研究所需的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)SVV VP1與VP3引物(表1)，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 目的基因獲取與擴(kuò)增參考SVV CH-01-2015病毒毒株序列(GenBank登錄號：KT321458.1)，將VP1與VP3基因片段交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以獲取的SVV cDNA為模板擴(kuò)增VP1與VP3片段。PCR反應(yīng)體系為25 μL體系：在PCR管中依次加入ddH2O 13.75 μL， 10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.5 μL、10 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL ，模板4 μL、Ex Taq酶 0.25 μL；SVV VP1與VP3基因的擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段備用。

表1 擴(kuò)增SVV VP1與VP3所需引物

注：下劃線部分為酶切位點(diǎn)，括號內(nèi)為酶切位點(diǎn)名稱

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-VP1與pET32a-VP3的構(gòu)建使用BamHⅠ/XhoⅠ分別雙酶切VP1片段、VP3片段以及pET32a質(zhì)粒，純化回收目的片段。分別將VP1與VP3連接至pET32a目的載體，對獲得的質(zhì)粒分別命名為pET32a-VP1、pET32a-VP3，并進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送往吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。將鑒定正確的pET32a-VP1、pET32a-VP3轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)，挑取單克隆菌落，震蕩培養(yǎng)12～14 h 后，保存菌液并提取質(zhì)粒鑒定。

1.6 VP1與VP3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)復(fù)蘇保存的pET32a-VP1、pET32a-VP3重組菌液，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液D600為0.4～0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液超聲處理后，以10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)。

1.7 Western blot試驗(yàn)使用1.6蛋白樣品，以10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂乳封閉2 h，鼠源His抗體孵育過夜，TBST洗滌3次，5 min/次，使用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗室溫孵育40 min，TBST洗滌3次后，5 min/次，顯影。

1.8 VP1與VP3重組蛋白表達(dá)形式分析復(fù)蘇保存的pET32a-VP1、pET32a-VP3重組菌(參照1.6方法)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收取菌液，經(jīng)超聲破碎后，5 000 r/min離心10 min，收取上清，取適量的PBS重懸沉淀，分別取上清、細(xì)菌包涵體制備樣品，用10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)。

1.9 VP1與VP3重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

1.9.1時(shí)間條件優(yōu)化 向試管中加入等量的VP1或VP3重組菌，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液D600為0.4～0.6時(shí)，加入等量的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。分別于誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5，6，7，8 h取等量的菌液，制備蛋白樣品，以10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，分析誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時(shí)間。

1.9.2誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化 向試管中加入等量的SVV VP1或VP3表達(dá)菌，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液D600為0.4～0.6時(shí)，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)5 h后，收集菌液，制備蛋白樣品，用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，分析最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1.9.3誘導(dǎo)溫度優(yōu)化 向試管中加入等量的VP1或VP3重組菌，振蕩培養(yǎng)至菌液D600為0.4～0.6時(shí)，加入0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，分別置于25，37℃誘導(dǎo)5 h，收集菌液，制備蛋白樣品，用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，分析最佳誘導(dǎo)溫度。

1.10 SVV VP1與VP3蛋白純化復(fù)蘇VP1或VP3重組菌，轉(zhuǎn)移至300 mL培養(yǎng)基中，于37℃條件下震蕩培養(yǎng)至菌液D600為0.4～0.6時(shí)，加入0.6 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)5 h，收集蛋白。參照說明書利用Ni2+-NTA金屬螯合蛋白質(zhì)純化柱進(jìn)行純化，制備蛋白樣品，用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，分析蛋白純化效果。

2 結(jié)果

2.1 SVV VP1與VP3基因擴(kuò)增利用VP1與VP3引物分別擴(kuò)增出約792，717 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致(圖1)。

圖1 SVV VP1(A)與VP3(B)基因擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；A1：VP1 PCR產(chǎn)物；A2.陰性對照;B1.VP3 PCR產(chǎn)物；B2.陰性對照

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-VP1與pET32a-VP3的構(gòu)建及鑒定將SVV VP1與VP3基因片段克隆至pET32a載體，獲取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ分別雙酶切pET32a-VP1與pET32a-VP3進(jìn)行鑒定，VP1與VP3基因片段成功克隆至pET32a載體(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-VP1(A)與pET32a-VP3(B)酶切鑒定 M1.DL5000 DNA Marker；M2.DL2000 DNA Marker；A1.pET32a-VP1重組質(zhì)粒；A2.pET32a-VP1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；B1.pET32a-VP3重組質(zhì)粒；B2.pET32a-VP3質(zhì)粒酶切產(chǎn)物

2.3 VP1與VP3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)收取誘導(dǎo)后的菌液，SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明pET32a-VP1重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后在約50 000處有明顯條帶，pET32a-VP3重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后在約48 000處有明顯條帶(圖3)；Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明2種重組菌均可見單一目的條帶(圖4)。

2.4 VP1與VP3重組蛋白表達(dá)形式分析分別收取pET32a-VP1與pET32a-VP3重組菌，分別獲取破碎細(xì)菌后的上清與包涵體， SDS-PAGE結(jié)果表明，2種重組菌均以包涵體的形式表達(dá)蛋白(圖5)。

圖3 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)表達(dá)SDS-PAGE驗(yàn)證 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a空載蛋白；A2：pET32a-VP1蛋白；B1.pET32a空載蛋白;B2.pET32a-VP3蛋白

圖4 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)表達(dá)Western blot驗(yàn)證結(jié)果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a-VP1；A2.pET32a空載體；B1.pET32a-VP3;B2.pET32a空載

圖5 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)表達(dá)形式驗(yàn)證結(jié)果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a-VP1重組菌上清；A2.pET32a-VP1重組菌包涵體； B1.pET32a-VP3重組菌上清；B2.pET32a-VP3重組菌包涵體

2.5 VP1與VP3重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.5.1優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間 于誘導(dǎo)后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h取等量的菌液，制備蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，結(jié)果表明：pET32a-VP1與pET32a-VP3重組菌均在誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量最高(圖6)。

2.5.2優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度 向等量重組菌加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明pET32a-VP1與pET32a-VP3重組菌均在誘導(dǎo)劑濃度大于等于0.6 mmol/L時(shí)表達(dá)量最高(圖7)。

2.5.3優(yōu)化誘導(dǎo)溫度 將重組菌分別置于25,37℃誘導(dǎo)5 h， SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明pET32a-VP1與pET32a-VP3重組菌均在37℃表達(dá)量較高(圖8)。

圖6 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分析結(jié)果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1～A9,B1～B9.誘導(dǎo)時(shí)間分別為0，1，2，3，4，5，6，7，8 h

圖7 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)誘導(dǎo)劑濃度分析結(jié)果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1～A6,B1～B6.誘導(dǎo)濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L

圖8 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)誘導(dǎo)劑溫度分析結(jié)果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.37℃誘導(dǎo)pET32a-VP1重組菌；A2.25℃誘導(dǎo)pET32a-VP1重組菌；B1.37℃誘導(dǎo)pET32a-VP3重組菌；B2.25℃誘導(dǎo)pET32a-VP3重組菌

2.6 VP1與VP3重組蛋白純化大量培養(yǎng)pET32a-VP1與pET32a-VP1重組菌，收集蛋白樣品，參照Ni2+-NTA金屬螯合蛋白質(zhì)純化柱說明書對蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果表明成功純化VP1與VP3重組蛋白(圖9)。

圖9 SVV VP1蛋白(A)與VP3蛋白(B)蛋白純化分析結(jié)果 M.Blue Plus蛋白Marker；A1.pET32a-VP1重組菌蛋白純化后；A2.pET32a-VP1重組菌蛋白純化前；B1.pET32a-VP3重組菌蛋白純化后；B2.pET32a-VP3重組菌蛋白純化前

3 討論

自2007年首次于加拿大豬群分離到該病毒株以來，全球已經(jīng)有多個(gè)國家相繼報(bào)道SVV感染豬群的病例[7]。2015年以來，多個(gè)國家相繼報(bào)道SVV流行與小范圍暴發(fā)，作為一種新發(fā)傳染病，已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，SVV在感染的豬群中可存在7～21 d，臨床癥狀持續(xù)12～14 d，病毒血癥持續(xù)1～10 d[18]。SVV與其他豬原發(fā)性水皰病癥狀基本類似，臨床上很難診斷。截止目前為止，尚未見研究證實(shí)SVV存活的環(huán)境以及其傳播方式的報(bào)道；然而，研究人員在小鼠腸道以及糞便中、家蠅中均檢測到SVV，表明這些物種可能會攜帶病原進(jìn)行傳播[19]。我國自2015年首次發(fā)現(xiàn)并分離SVV毒株以來，已經(jīng)有多個(gè)省份報(bào)道檢測到SVV；研究人員對2016-2018年的部分省份樣品進(jìn)行回顧性檢測，發(fā)現(xiàn)我國的部分省份早在2016年即已經(jīng)存在SVV感染豬群[7]。

研究人員使用pET24b系統(tǒng)表達(dá)SVV VP1、VP2、VP3蛋白，并建立間接ELISA方法，研究顯示使用VP2蛋白包被建立的ELISA方法優(yōu)于VP1與VP3蛋白包被建立的ELISA方法[20]。SVV VP1、VP3蛋白含有多個(gè)抗原表位，是新型疫苗研發(fā)的首選蛋白區(qū)域[21]，尚未見研究利用SVV VP1、VP3表達(dá)的蛋白建立中和等檢測方法的報(bào)道。本試驗(yàn)將SVV VP1與VP3的基因片段克隆至pET32a(+)載體，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對SVV VP1與VP3區(qū)域蛋白進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示分別以包涵體的形式表達(dá)出約50 000,48 000的重組蛋白；并對兩者的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。利用Ni2+-NTA金屬螯合蛋白質(zhì)純化柱對原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的SVV VP1與VP3蛋白進(jìn)行純化，成功純化出SVV VP1與VP3蛋白。SVV VP1與VP3蛋白的表達(dá)與純化，為下一步研究SVV單克隆及多克隆抗體的制備、新型疫苗研發(fā)及血清學(xué)檢測方法等奠定基礎(chǔ)。