曹 亮，孫文超，汪 偉，田明堯，郭丹丹，劉云霞，鄭 敏，錢愛(ài)東，魯會(huì)軍*，金寧一,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2.軍事科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 325035； 4.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530004；5.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧530001)

豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)為無(wú)囊膜的單鏈DNA病毒[1-2]。該病毒于1965年在德國(guó)被首次檢測(cè)到，并確定是造成懷孕母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎及胚胎早期死亡，造成豬生殖障礙的主要原因[3-5]。近10年間，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不同基因型豬細(xì)小病毒PPV2～PPV6。2016年，美國(guó)首次檢測(cè)到新的細(xì)小病毒基因型PPV7[6]。這些細(xì)小病毒在分類學(xué)上共分為4個(gè)屬，其中PPV1屬于Protoparvovirus屬，PPV2與PPV3屬于Tetraparvovirus屬，PPV4～PPV6屬于Copiparvovirus屬，而PPV7屬于Chapparvovirus屬[6-7]。盡管近年來(lái)年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)PPV2-PPV7不同基因型的細(xì)小病毒，同時(shí)也證實(shí)它們?cè)谪i群中的感染相當(dāng)普遍，但是由于缺少相關(guān)臨床報(bào)道及感染的無(wú)明顯癥狀，以致它們所引起的臨床癥狀仍不清楚。

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原之一。研究表明，PPV可與PCV2協(xié)同致病[8]。為了進(jìn)一步了解PPV7在豬群中的流行情況及是否與PCV2共感染，本試驗(yàn)對(duì)2017年廣西部分地區(qū)PPV7流行及與PCV2共感染作為流行病學(xué)調(diào)查內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 樣品采集樣品為2017年采集于廣西南寧、博白、玉林、東興等城市的健康及患病豬共計(jì)247份樣品，包括血液及內(nèi)臟組織器官(肺、脾、肝、腎及腹股溝淋巴結(jié))樣品。

1.2 主要試劑和儀器大腸桿菌Trans5α、平末端連接載體pEASYR-Bluent Zero Cloning Kit，E.coliDH5α購(gòu)自于北京全式金生物公司；2×pfu Master Mix(Dye)購(gòu)自于江蘇康維生物有限公司；血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒購(gòu)自于天根生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自于杭州博日科技有限公司；TS系列多樣品組織研磨機(jī)購(gòu)自于上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 病毒DNA的提取將采集豬組織樣品置于2 mL EP管內(nèi)，并加入1 mL PBS(pH7.4)緩沖液后置于組織振蕩器內(nèi)，70 Hz頻率振蕩研磨10 min。將研磨好的樣品于-20℃冰箱凍融3次，取出200 μL樣品參照血液/細(xì)胞/病毒基因組DNA提取試劑盒操作提取總DNA，置于-20℃冰箱貯存。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成參照GenBank登錄的PPV7及PCV2全基因組序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件進(jìn)行分析，篩選出高度保守的核苷酸區(qū)域，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增PPV7全基因組引物及PCV2檢測(cè)引物(表1)，并將引物序列由吉林庫(kù)美生物技術(shù)公司合成。

1.5 PCR檢測(cè)利用提取的組織和血液DNA，采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)感染情況，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×pfu Master Mix(Dye) 12.5 μL，每組各0.5 μL(20 μmol/ L)，基因組模板1 μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、5 min,變性94℃、30 s，退火30 s,退火溫度和延伸時(shí)間按照表1進(jìn)行，35個(gè)循環(huán)后72℃、10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并按照膠回收試劑盒說(shuō)明純化。

1.6 基因克隆回收純化后連接pEASYR-Bluent Zero Cloning Kit載體，并轉(zhuǎn)化至Trans5α，涂布在含有氨芐青霉素的LB平皿培養(yǎng)12 h。挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后少量提取質(zhì)粒送吉林省庫(kù)美生物有限公司測(cè)序。

1.7 序列分析應(yīng)用MEGA7.0軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的PPV7參考株序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并以LG+G+I算法1 000步展值生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析基因分群。

表1 PPV7和PCV2基因擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 PPV7及PCV2感染情況PCR檢測(cè)結(jié)果在采集的172份健康豬樣品及75份患病豬樣品中，PPV7感染率高達(dá)71.66%(177/247)(表2)。而在所有陽(yáng)性樣品中，有63份樣品來(lái)自患病豬(63/75，84%)，114份樣品來(lái)自健康豬(114/172，66.2%)。在所采集的樣品中PCV2感染率為86.6%，在247份樣品中共有214份檢測(cè)為PCV2陽(yáng)性，其中65份陽(yáng)性樣品來(lái)自于患病豬(65/75，86.67%)，149份樣品來(lái)自于健康豬(149/172，86.62%)。在患病豬樣品中PCV2與PPV7共感染率為77.33%(58/75)，而健康豬兩者共感染率為51.74(89/172)。

表2 樣品來(lái)源及檢測(cè)結(jié)果

2.2 PPV7基因同源性分析隨機(jī)選取3株P(guān)PV7陽(yáng)性樣品進(jìn)行主要結(jié)構(gòu)基因組測(cè)序。結(jié)果顯示PPV7基因組序列包含2個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1及Cap蛋白。3株P(guān)PV7全部編碼區(qū)基因同源性為94.1%～99.6%，NS1基因同源性為96.0%～100%，cap基因同源性為93.9%～97.6%。通過(guò)與PPV7參考序列PPV7 42株分析，本試驗(yàn)3株P(guān)PV7其NS1基因序列同源性為94.9%～96.6%，cap基因序列同源性為89.6%～95.0%。與中國(guó)的3株P(guān)PV7分離株GD2014-1，GD2014-2及GD2014-3分析顯示其NS1基因同源性為94.2%～97.6%，而cap基因同源性為87.4%～94.6%。結(jié)果顯示無(wú)論與國(guó)外的PPV7參考株還是國(guó)內(nèi)分離株比較，本試驗(yàn)所檢測(cè)的PPV7其cap基因均存在較大差異。

2.3 PPV7cap基因序列分析通過(guò)對(duì)參考株及中國(guó)分離株序列分析顯示，PPV7cap基因全長(zhǎng)為1 410 nt或1 425 nt。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的3株P(guān)PV7中，其cap基因長(zhǎng)度為分別為1 425 nt，1 413 nt和1410 nt。本試驗(yàn)所測(cè)序的3株P(guān)PV7基因中，有2株在其cap基因中間增加3個(gè)或15個(gè)核苷酸序列(圖1A)。

通過(guò)對(duì)4株參考株及3株分離株Cap蛋白氨基酸序列分析顯示：本研究的PPV7其Cap蛋白在182～187位aa較參考株增加1個(gè)或5個(gè)氨基酸殘基，以及在編碼的氨基酸序列中存在2個(gè)變異區(qū)域(圖1B)：296～299aa及439～443aa。而PPV7 Cap蛋白氨基酸序列突變的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)其遺傳演變提供一定的參考價(jià)值。

圖1 PPV7 cap基因核苷酸(A)及氨基酸序列(B)分析

2.4 PPV7遺傳進(jìn)化分析將所擴(kuò)增的3株P(guān)PV7 NS1氨基酸序列與33株細(xì)小病毒科成員應(yīng)用生物學(xué)軟件MEGA7.0以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的3株P(guān)PV7與參考株均屬于Chapparvovirus屬(圖2)。

3 討論

20世紀(jì)60年代，通過(guò)對(duì)豬的流產(chǎn)、死胎病原學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，豬細(xì)小病毒是引起這些臨床癥狀的病原體之一。而后陸續(xù)在歐洲、美洲及亞洲等多國(guó)家均檢測(cè)到該病原的存在[8]。目前，豬細(xì)小病毒感染存在與世界各大豬養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失。研究表明，PPV1在豬場(chǎng)的感染率為25.8%～71.88%，且PPV1與PCV2常以混合感染的形式存在[9]。PPV7于2016年在成年豬腸拭子中被首次檢測(cè)到，且常與PPV2及PCV1混合感染。以往的研究顯示，PPV7在美國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)采集的血液及肺臟樣品中感染率為2.1% (2/95)和17.2% (5/29)，在中國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)采集的血液樣品感染率為65.5% (19/29)[6,10]。而本試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PPV7在血液及肺臟樣品中感染率顯著高于以往的研究，這表明PPV7可能在廣西豬養(yǎng)殖場(chǎng)有較高的感染率。由于本研究所采集的樣品數(shù)量有限，對(duì)于PPV7實(shí)際的感染情況仍需更為詳盡的調(diào)查研究。

圖2 PPV7進(jìn)化分析

PCV2是引起PMWS的主要病原，且PCV2與其他病毒(如PPV、PRRSV等)病原在其誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞耗竭后引起繼發(fā)感染[11]。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)感染PCV2相比，共感染PCV2和PPV的豬會(huì)發(fā)生更嚴(yán)重的疾病及病變[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PPV7與PCV2高度共感染率，表明PPV7可能是PCV2病毒所引起疾病的重要輔助因子，但是仍然需要進(jìn)一步的證明。

本研究團(tuán)隊(duì)自2015年以來(lái)就開(kāi)始關(guān)注新型豬細(xì)小病毒的研究，陸續(xù)建立針對(duì)新型細(xì)小病毒的檢測(cè)方法，展開(kāi)對(duì)新型細(xì)小病毒的流行病學(xué)調(diào)查，關(guān)注新型細(xì)小病毒對(duì)豬群的健康的影響，對(duì)新型豬細(xì)小病毒的疫苗及預(yù)防提供積極有效的預(yù)防和診斷手段[13-14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PPV7與PCV2存在較高的共感染情況，同時(shí)對(duì)廣西地區(qū)PPV7流行毒株遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)的3株P(guān)PV7毒株與以往中國(guó)所報(bào)道的參考株其cap基因存在較大差異。