任 杰，葛 猛*，李潤成，鄭 金，凌 同，黎滿香，李岱霞，張 磊，余興龍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南中岸生物藥業(yè)有限公司 工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410100)

豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，被世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)列為必報的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病[1-2]。因為豬瘟兔化弱毒疫苗在我國長期使用，基本控制了CSF大規(guī)模流行。但是，一些低毒力毒株感染引起的慢性豬瘟及持續(xù)性感染還普遍存在[2]，仍然嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。對該病的控制和凈化一直是我國動物疫病防治的重要目標(biāo)，根據(jù)《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020)》的要求，我國要逐步實現(xiàn)豬瘟的凈化。國外多個發(fā)達(dá)國家通過停止使用疫苗結(jié)合野毒的免疫監(jiān)測及撲殺，實現(xiàn)了豬瘟的凈化，而我國目前完全停止使用疫苗的條件還不成熟，通過疫苗免疫結(jié)合鑒別診斷篩選并撲殺野毒感染豬的綜合措施更加適合現(xiàn)階段我國的豬瘟凈化工作。在E2亞單位疫苗被成功開發(fā)并且逐步應(yīng)用于臨床的情況下，適用于臨床大規(guī)模、高通量檢測的免疫學(xué)鑒別診斷方法成為豬瘟凈化工作的一個關(guān)鍵。

CSFV屬黃病毒科瘟病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，CSFV基因組約為12.3 kb[3]，編碼1個由3 898個氨基酸組成的多聚蛋白[4]，在病毒蛋白酶和宿主細(xì)胞酶的作用下被加工成12個成熟蛋白[5]，其中Erns和E2為豬瘟的2個主要保護性抗原[6]，而E2誘導(dǎo)中和抗體的能力最強，目前,CSFV基因工程疫苗主要基于E2蛋白進行研究和開發(fā)。CSFV Erns蛋白是除E2蛋白之外具有較強抗原反應(yīng)性的蛋白[6]，是一個潛在的用于建立豬瘟野毒感染的血清學(xué)鑒別診斷方法的抗原。目前國外已經(jīng)有針對Erns抗體檢測的商品化試劑盒，但是普遍存在檢測敏感性不足的問題[7]。最近，QIAGEN公司新開發(fā)的Erns抗體檢測試劑盒開始進入我國，但是其具體的檢測效果還有待臨床驗證。無論如何，進口試劑盒的價格昂貴，不利于臨床大規(guī)模應(yīng)用，因此，研究Erns抗體檢測方法及試劑盒仍然十分有必要。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和主要試劑連接有完整CSFV Erns基因的質(zhì)粒pET28a-Erns由南京金斯瑞公司合成；大腸桿菌 DH5α由本實驗室保存；大腸桿菌DH10Bac、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1，購自Invitrogen公司；EcoRⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司；Pfu DNA 聚合酶、DNA 聚合酶均購自北京天恩澤基因科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Reagent和優(yōu)級胎牛血清購自GIBCO公司，ECL顯色試劑盒購自MILLIPORE公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豬IgG(酶標(biāo)二抗)、TMB均為KPL公司產(chǎn)品；96孔酶標(biāo)板以及細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning公司產(chǎn)品；Ni-IDA為武漢匯研生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞與培養(yǎng)基Sf9昆蟲細(xì)胞、High Five昆蟲細(xì)胞購自Invitrogen公司；Grace's培養(yǎng)基、Express Five培養(yǎng)基購自GIBCO公司。

1.3 血清與試劑盒血清包括CSFV陰性血清56份、免疫CSFV弱毒疫苗臨床豬血清126份、CSFV野毒攻毒試驗豬血清45份和免疫CSFV E2亞單位疫苗豬血清92份，共319份。除CSFV野毒攻毒試驗豬血清(已滅活)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈外，其他血清均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子生物與免疫學(xué)實驗室保存。

IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒為美國IDEXX公司產(chǎn)品，檢測CSFV E2抗體(批號：M301)；pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品，檢測CSFV Erns抗體(批號：254110828)。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-Erns的構(gòu)建與鑒定根據(jù)pET28a-Erns質(zhì)粒序列，設(shè)計1對引物，上游引物5′端包含EcoRⅠ酶切位點、3個保護性堿基和Kozak序列，含有原有信號肽。下游引物在終止密碼子前加入了編碼6個組氨酸的堿基序列和SalⅠ酶切位點。預(yù)計PCR擴增產(chǎn)物長度為705 bp。

Erns-F：5′-CGCGAATTCACCATGGAAAAA-GCCCTATTGGCTTG-3′；

Erns-R：5′-CCGGTCGACTTAATGGTGATGGTGATGATGGGCCCTTGCCGCACCCTGCC-3′。

以pET28a-Erns質(zhì)粒為模板，Erns-F和Erns-R為引物，用Pfu DNA 聚合酶擴增表達(dá)片段。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，共30個循環(huán)；68℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L EB)進行電泳檢測。

將目的基因PCR擴增片段進行膠純化，用EcoRⅠ和SalⅠ進行消化后連接到經(jīng)同樣酶消化的pFastBacⅠ載體質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗生素平板上進行篩選，挑取陽性克隆進行擴增，小量提取質(zhì)粒，進行EcoRⅠ和SalⅠ酶切鑒定，篩選得到陽性轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。序列測定以驗證插入序列的正確性，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFastBac-Erns。

1.5 表達(dá)Erns重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定將pFastBac-Erns轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選提取桿粒，PCR鑒定重組桿粒rBacmid-Erns。采用Cellfectin Reagent將rBacmid-Erns轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的Sf9昆蟲細(xì)胞，經(jīng)5～7 d直至細(xì)胞出現(xiàn)病變時，提取重組桿狀病毒基因組DNA，用Erns-F和特異性M13下游引物進行PCR擴增，鑒定重組桿狀病毒，擴增種毒，空斑測定病毒滴度，將獲得的重組桿狀病毒命名為rBac-Erns，4℃避光保存。

1.6 Erns的表達(dá)、純化與WB鑒定重組桿狀病毒rBac-Erns接種對數(shù)期生長的High Five昆蟲細(xì)胞，27℃表達(dá)96 h，收集上清，10 000×g離心后，通過Ni-IDA進行親和層析純化。取表達(dá)產(chǎn)物直接進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含0.2%明膠的PBST室溫封閉1 h，以1∶2 000稀釋的鼠抗Erns抗體為一抗，4℃孵育過夜，PBST洗滌，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，作用45 min，ECL顯色試劑盒檢測。

1.7 間接ELISA方法(Erns-iELISA)的建立

1.7.1最適抗原工作濃度和血清稀釋度的確定 用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將純化的重組蛋白倍比稀釋到2.4，1.2，0.6 mg /L后，以每孔100 μL加入到96孔酶標(biāo)板，4℃包被24 h。將經(jīng)IDEXX CSFV E2抗體檢測試劑盒和pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒共同確認(rèn)為陽性和陰性的血清分別以1∶50，1∶100，1∶200進行倍比稀釋后，進行方陣滴定；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG以1∶6 000稀釋，用TMB顯色，2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定D450 nm值，P/N值最大時的抗原濃度和血清稀釋度作為最適抗原工作質(zhì)量濃度和血清稀釋度。

1.7.2反應(yīng)條件的優(yōu)化 選用確定的最適抗原濃度和血清稀釋度，分別對酶標(biāo)二抗的工作濃度、封閉時間、底物反應(yīng)時間等進行優(yōu)化，每次檢測D450 nm值，按P/N值最大的原則確定最佳反應(yīng)條件。

1.7.3判斷標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定 在ELISA反應(yīng)條件確定后，選取經(jīng)IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒、pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒和PCR確認(rèn)為病毒核酸陰性的CSFV抗體陰性血清56份，按照上述最佳工作條件進行檢測，計算其平均S/P值{S/P值=(樣品檢測D450 nm值-參考陰性血清D450 nm值)÷(參考陽性血清D450 nm-參考陰性血清D450 nm值)}和標(biāo)準(zhǔn)偏差s值，根據(jù)公式(平均S/P值+3×s值)計算臨界值，確定其結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 敏感性和靈敏度試驗選取經(jīng)pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒或IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒檢測為陽性的171份血清，其中免疫CSFV弱毒疫苗臨床豬血清126份，CSFV野毒攻毒試驗豬血清45份，用Erns-iELISA方法進行檢測，以上述2種試劑盒檢測結(jié)果為參照，根據(jù)檢測結(jié)果的陽性率來分析其檢測敏感性；再選取2份上述2種試劑盒檢測均為陽性的血清分別從1∶100開始，倍比稀釋至1∶6 400，按最佳檢測條件進行ELISA檢測，確定該方法的靈敏度。

1.9 特異性和交叉反應(yīng)性試驗選取經(jīng)pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒檢測為陰性的92份血清，用Erns-iELISA方法進行檢測，以pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒結(jié)果為參考，分析Erns-iELISA方法的檢測特異性；再用Erns-iELISA方法分別檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2(PCV2)的陽性血清，每份血清做3個平行重復(fù)，分析Erns-iELISA與其他病毒血清的交叉反應(yīng)性。

1.10 重復(fù)性選取CSFV抗體陽性和陰性的豬血清12份，每個樣品做3孔重復(fù)，分別在同一塊抗原包被板上和3塊不同批次的抗原包被板上檢測，計算每份血清的變異系數(shù)以及所有血清的平均變異系數(shù)，值越小表示差異越小，其中同一塊板上的結(jié)果表示批內(nèi)差異，不同板上的檢測結(jié)果表示批間差異。

2 結(jié)果

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-Erns的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，在705 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相同(圖1A)，經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ消化的Erns與經(jīng)同樣酶消化的pFastBacⅠ載體進行連接，轉(zhuǎn)化后挑取菌落擴菌，提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定，結(jié)果均出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖1B)。

圖1 Erns的PCR擴增和pFastBac-Erns雙酶切鑒定 A.Erns的PCR擴增，A1.目的基因PCR結(jié)果；M1.DL2000 DNA Marker；A2.陰性對照;B.pFastBac-Erns質(zhì)粒雙酶切，M2：DL10000 DNA Marker；B1.pFastBac-Erns雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組桿狀病毒PCR鑒定重組桿粒轉(zhuǎn)染rBacmid-Erns轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)病變后提取重組桿狀病毒基因組DNA，用Erns-F和M13下游引物PCR擴增，出現(xiàn)特異性條帶(圖2)。

圖2 重組桿狀病毒PCR鑒定 1.重組桿狀病毒PCR產(chǎn)物；2.陰性對照；M.DL2000 DNA Marker

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot檢測收集重組桿狀病毒感染High Five細(xì)胞96 h后上清進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，以鼠抗Erns抗體為一抗，Western blot顯示特異性條帶(圖3A)。全部上清經(jīng)親和層析純化(圖3B)，用BCA法測定重組蛋白質(zhì)量濃度約為0.12 g/L。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物Western blot檢測和純化后SDS-PAGE M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；A.表達(dá)產(chǎn)物Western blot檢測;A1～A3.表達(dá)產(chǎn)物；A4.陰性對照;B.表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析純化后SDS-PAGE；B1.表達(dá)產(chǎn)物；B2.流穿；B3.洗滌；B4、B5.洗脫

2.4 間接ELISA方法的反應(yīng)條件根據(jù)方陣滴定及各項試驗條件優(yōu)化的結(jié)果，最終確定ELISA的程序如下：抗原包被量為120 ng/孔，血清稀釋倍數(shù)為100倍 (表1)，封閉30 min，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為6 000 倍，底物作用15 min，臨界值為0.329。

2.5 特異性試驗經(jīng)pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒檢測為陰性的92份血清，用Erns-iELISA方法檢測的結(jié)果為陰性81份，陽性11份，檢測特異性為88.04%。

Erns-iELISA方法對PCV2、PRRSV、PEDV陽性血清檢測的S/P值均小于0.3，判定為陰性，顯示Erns-iELISA方法與PCV2、PRRSV、PEDV無交叉反應(yīng)(表2)。

2.6 敏感性試驗對171份CSFV陽性血清，Erns-iELISA檢測結(jié)果為陽性159份，檢測敏感性為92.98%；對其中45份CSFV野毒攻毒試驗豬血清，Erns-iELSIA、pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒、IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒的敏感性分別為：93.33%、95.56%和95.56%。對于126份CSFV弱毒疫苗免疫豬血清，Erns-iELISA、pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒、IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒的敏感性分別為92.86%，49.21%和100%(表3)。

表1 ELISA方陣滴定結(jié)果

表2 血清交叉反應(yīng)檢測結(jié)果

注：“+”為陽性，“-”為陰性。下同

表3 敏感性試驗

對選取的2份CSFV抗體陽性血清，分別從1∶100開始，倍比稀釋至1∶6 400，按最佳ELISA檢測條件進行檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)2份血清分別稀釋至1∶3 200和1∶800時，其對應(yīng)S/P值分別為0.34和0.32，仍為陽性。該方法對選取的2份CSFV陽性血清的敏感度分別為1∶3 200和1∶800，表明Erns-iELISA方法具有較高的敏感度(表4)。

2.7 重復(fù)性試驗批內(nèi)差異分析顯示，12份陽性血清變異系數(shù)為5.27%～9.53%，平均7.4%，而批間差異分析顯示，變異系數(shù)為8.35%～13.13%，平均10.74%；12份陰性血清的批內(nèi)和批間差異較小，表明Erns-iELISA方法具有較好的重復(fù)性。

表4 敏感度檢測

3 討論

Erns蛋白由CSFV多聚蛋白的第268位谷氨酸至第494位丙氨酸的227個氨基酸組成[8]，其碳骨架約為26 000，第2、7、11、65、95、143、158位氨基酸為潛在糖基化位點[9-10]，是一個高度糖基化蛋白，其相對分子質(zhì)量隨糖基化程度不同而改變，天然Erns蛋白相對分子質(zhì)量為44 000～48 000，主要以相對分子質(zhì)量約為90 000的同源二聚體形式存在[11-12]，N-糖苷約占其相對分子質(zhì)量的50%，且有助于蛋白的正確折疊加工和分泌[13]。

雖然有研究者證明經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的不同Erns片段也具有較好的抗原反應(yīng)性[14-15]，但是一般來說病毒結(jié)構(gòu)蛋白的糖基化會影響蛋白的構(gòu)象和抗體的產(chǎn)生。研究證明，只有糖基化的Erns蛋白才能對致死量CSFV的攻擊形成保護[10]。因此，獲得具有正確構(gòu)象和糖基化的Erns蛋白對于保證其抗原活性并建立Erns抗體檢測方法至關(guān)重要。據(jù)報道，使用原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CSFV Erns蛋白，并且建立相應(yīng)的抗體檢測ELISA方法，具有一定的效果[16-17]。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)與原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，在外源蛋白的翻譯后修飾與哺乳動物細(xì)胞更為相似[18]，表達(dá)出的外源蛋白更接近其天然結(jié)構(gòu)，且外源蛋白的表達(dá)量一般較哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更高。因此，本試驗選擇桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)CSFV Erns蛋白并建立Erns抗體檢測間接ELISA方法。

我國CSFV遺傳變異情況相對穩(wěn)定，CSFV 2.1b亞型是我國當(dāng)前的優(yōu)勢流行毒株[19]，與CSFV疫苗毒株Erns蛋白的核苷酸同源性為82.3%～84.3%，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為86.4%～89.5%[20]，存在一定的差異。為了增加Erns-iELISA方法對CSFV流行毒株的敏感性，本試驗選擇國內(nèi)CSFV流行毒株的Erns基因序列進行人工合成并表達(dá)。試驗發(fā)現(xiàn)，直接取表達(dá)產(chǎn)物進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后看不見目的條帶，但是Western blot能檢測到目的蛋白，說明Erns蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量不高，但是通過親和層析方法依然能成功純化到。

在對Erns-iELISA進行敏感性分析的時候，我們發(fā)現(xiàn)對于野毒感染血清，該方法及pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒與IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒都有較高的檢測敏感性。而對于弱毒疫苗免疫豬血清，Erns-iELISA與IDEXX CSFV抗體檢測試劑盒的檢測敏感性明顯高于pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒。因此提示pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒可能存在對于部分類似疫苗毒毒株的抗體檢測敏感性偏低的問題。綜合野毒感染血清和弱毒疫苗免疫豬血清的檢測結(jié)果分析，Erns-iELISA具有較高的檢測敏感性(92.98%)。

對于免疫E2亞單位疫苗的豬群，理論上在沒有感染野毒的情況下，豬群的Erns抗體呈陰性，因此本試驗選擇CSFV E2亞單位疫苗免疫豬的血清對Erns-iELISA的特異性進行評價。參考pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒的結(jié)果，Erns-iELISA的檢測特異性為88.04%，少部分血清用Erns-iELISA方法檢測呈陽性的原因可能是由于國內(nèi)長期使用CSFV弱毒疫苗，免疫E2亞單位疫苗的豬群可能殘留弱毒疫苗抗體，以及Erns-iELISA檢測弱毒疫苗抗體的敏感性高于pigtype CSFV Erns抗體檢測試劑盒所致。為了進一步確定該方法的檢測特異性，我們選擇了PCV2、PRRSV、PEDV陽性血清進行了交叉反應(yīng)性試驗，結(jié)合2個方面的試驗，證明Erns-iELISA具有較好的檢測特異性。但是，與牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)豬陽性血清的交叉反應(yīng)性還有待驗證。

綜上所述，本試驗通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CSFV Erns蛋白具有良好的抗原反應(yīng)活性，且用其作為診斷抗原建立了檢測Erns抗體的Erns-iELISA方法，初步分析和評估表明該方法對CSFV疫苗毒和國內(nèi)流行毒株抗體都具有較高的檢測敏感性，同時具有較高的檢測特異性，且重復(fù)性好，具有潛在的開發(fā)和應(yīng)用價值。