王 旭，蔡夢露，馬振乾，陳 潔，龔文杰，常曉冉，張澤財，涂長春，王新平*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院/教育部人獸共患病研究重點實驗室，吉林 長春 130062；2.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266032；3.軍事醫(yī)學研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病[1]，為國家法定的一類動物疫病和OIE通報性疫病之一[2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。豬瘟病毒屬于黃病毒科、瘟病毒屬的成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒,基因組約為12.3 kb[3-6]。豬瘟病毒只有1個血清型。根據(jù)病毒核苷酸序列的差異，病毒分為3個基因型，即基因1型、基因2型和基因3型[7]。病毒的基因組含有1個大的開放閱讀框，可編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1、E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白 (Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)[8-10]。 在結(jié)構(gòu)蛋白中，C蛋白為病毒的衣殼蛋白，E0、E1、E2為病毒的囊膜蛋白[11]。其中，E0蛋白由227個氨基酸組成，約為25 000，是誘導產(chǎn)生中和抗體的主要保護性抗原之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，E0蛋白具有RNA酶活性，可以水解宿主細胞內(nèi)的RNA影響干擾素的表達從而引起病毒的持續(xù)感染[13]。E0蛋白可經(jīng)細胞分泌到細胞培養(yǎng)基中，是一種分泌型蛋白，參與介導早期病毒對細胞的感染[14-15]。E0蛋白含有3個抗原表位，分別位于332～412，351～427和376～487位氨基酸，后2個抗原表位為構(gòu)象表位[16]。序列比較分析發(fā)現(xiàn)，E0蛋白的氨基酸序列比E2序列更加保守，不同毒株之間的同源性較高[17]，是進行抗體檢測的候選蛋白。

目前，國內(nèi)預防豬瘟多采用新疆天康生物公司研制的豬瘟病毒E2亞單位疫苗[18]。該疫苗免疫后可以引導豬群產(chǎn)生針對E2蛋白的抗體，但應用檢測E2抗體的試劑盒無法區(qū)分豬群中是否存在野毒感染。LANGEDIJK等[19]發(fā)現(xiàn)，在豬瘟野毒感染后，豬體內(nèi)會產(chǎn)生針對E2、E0和NS2-3蛋白的抗體，而針對NS2-3蛋白的抗體不能用于鑒別診斷。DE SMIT等[20]發(fā)現(xiàn)，E2亞單位疫苗免疫豬在攻毒14 d后仍可以檢測到E0蛋白的抗體，因此可通過檢測E0蛋白的抗體確定豬群中是否存在野毒感染。本試驗通過構(gòu)建豬瘟病毒E0蛋白基因的2種原核表達載體，并應用表達純化的GST-E0和His-E0重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測豬瘟病毒E0蛋白抗體的間接ELISA方法，并與IDEXX E2檢測試劑盒平行檢查部分臨床樣品；同時應用IFA方法，進一步確證了His-E0 ELISA方法與IDEXX E2試劑盒的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)建立的檢測E0抗體的間接ELISA方法具有特異性強、敏感性高和重復性好等特點，為臨床上鑒別豬瘟病毒野毒感染提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病料、血清、菌種及質(zhì)粒豬瘟病料、豬瘟陽性和陰性血清由青島易邦生物工程有限公司提供；豬瘟病毒疫苗C株由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所所保存并提供；TOP10和BL21感受態(tài)細胞由本實驗室保存；pGEX-4T-1和pET-28a原核表達載體由本實驗室保存。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、RNAiso Plus購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司；Proteinc Marker購自全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標記羊抗豬IgG購自Immunoway公司；FITC標記羊抗豬IgG購自Solarbio公司。

1.3 病料總RNA的提取豬瘟病料中的總RNA采用TaKaRa公司生產(chǎn)的RNAiso Plus試劑提取。組織RNA的提取及cDNA的合成參照文獻[21]進行。

1.4 CSFVE0基因的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)豬瘟病毒的核苷酸序列，設(shè)計擴增豬瘟病毒E0基因的引物如下：CSFV-E0-S:5′-CCGGAATTCCTCAGAGGGGTCAATAGGAGC- 3′； CSFV-E0-AS:5′-CCGCTCGAGGTAGGCACCGAACCAGGTTTTG- 3′。將RT-PCR擴增的目的片段進行雙酶切后，分別克隆到pGEX-4T-1和pET-28a載體的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位點上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)中，挑取單菌落、培養(yǎng)與提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。

1.5 重組蛋白的表達與純化將pGEX-4T-1-E0和pET-28a-E0重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)中，挑取單菌落，培養(yǎng)細菌D600至0.6～0.8后，加入1 mmol/L的IPTG 37℃誘導3 h后收集菌體，進行SDS-PAGE分析。GST-E0重組蛋白純化參照文獻[22]方法進行，即將表達蛋白的菌以上述方法大量誘導，收集的菌體超聲破碎后，以10 000 r/min離心15 min，包涵體沉淀用1.5 mol/L尿素反復洗后，溶解到8 mol/L尿素中。

1.6 重組蛋白的免疫學鑒定純化蛋白以SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，并以5%的脫脂奶粉封閉1 h。以PBST洗滌后，加入稀釋的陽性血清，室溫孵育1 h 后,加入HRP標記的山羊抗豬IgG二抗，室溫孵育45 min,以同樣方法洗滌后，加入ECL發(fā)光液顯色。

1.7 抗原最佳包被量與血清最佳稀釋度的確定采用方陣滴定法進行。將純化的GST-E0和His-E0重組蛋白按照25,50,100,200,400 ng/孔包被酶標板，4℃放置過夜；以0.01 mmol/L PBS洗滌液(pH7.2,含有0.05%Tween-20)洗板3次，加入5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h；再用PBS-T洗滌3次后分別加入20，40，80，160，320，640，1 280倍稀釋的陽性和陰性血清，37℃孵育1 h。再次洗滌后，加入1∶5 000倍稀釋的HRP 標記的羊抗豬的二抗，37℃孵育45 min。PBS-T洗滌3次后加入OPD顯色試劑，每孔100 μL。室溫避光顯色15 min，加入2 mol/L H2SO4100 μL終止反應，測定D490值。

1.9 特異性試驗以建立的間接ELISA方法對PRRSV、PCV2、PEDV、PRV感染的陽性血清樣品進行檢測，同時用豬瘟陽性血清和陰性血清做對照，確定檢測豬瘟血清抗體的間接ELISA方法的特異性。

1.10 重復性試驗應用3份豬瘟陽性血清和3份陰性確定試驗的板間和板內(nèi)重復性。根據(jù)測定的D490值，計算標準差與差異系數(shù)。

1.11 敏感性試驗將豬瘟陽性血清樣品用PBS按照1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280進行倍比稀釋，然后以GST-E0和His-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法進行檢測，確定該方法的敏感性。

1.12 間接ELISA方法與IDEXX試劑盒的平行比較試驗以GST-E0、His-E0間接ELISA和IDEXX E2試劑盒平行檢測88份臨床血清樣品，分別確定2種ELISA方法與IDEXX E2試劑盒的符合率。

1.13 本試驗建立的間接ELISA和IDEXX試劑盒分別與間接免疫熒光(IFA)的符合率以豬瘟病毒疫苗C株和CSFV野毒株感染的細胞為抗原，應用IFA試驗，分別檢測His-E0 ELISA方法和IDEXX E2試劑盒檢出的陰性和陽性樣品，確證His-E0 ELISA方法和IDEXX E2試劑盒方法的檢測結(jié)果。同時設(shè)置未接毒細胞為空白對照。

1.14 間接ELISA方法的初步應用以His-E0建立的間接ELISA方法檢測采自某地區(qū)豬瘟疫苗免疫的5個種豬群的血清E0抗體，每個豬群樣品數(shù)量為20頭份，確定豬瘟E0抗體的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 CSFVE0基因的擴增如圖1所示，應用RT-PCR方法，擴增出預期大小為615 bp 的E0基因片段。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與酶切鑒定如圖2所示，重組質(zhì)粒以XhoⅠ或EcoRⅠ進行單酶切和雙酶切進行鑒定，得到預期大小的片段，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的表達與純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21中進行誘導表達，表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3所示，誘導菌成功表達目的蛋白，GST-E0大小為48 000，His-E0大小為23 000。

2.4 重組E0蛋白的Western blot鑒定如圖4所示，Western blot鑒定GST-E0和His-E0重組蛋白與豬瘟陽性血清均發(fā)生特異性反應。

2.5 最佳抗原包被量與血清最佳稀釋度的確定方陣滴定法確定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分別為50 ng/孔和100 ng/孔，血清最佳稀釋度為160倍(表1,2)。

2.6 間接ELISA方法的判定標準以GST-E0和His-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測80份陰性血清，測得D490值后，計算出平均值、標準差和臨界值。結(jié)果如表3所示，以GST-E0重組蛋白為包被抗原，被檢測樣品D490≥0.167時判定為陽性，否則判定為陰性；以His-E0重組蛋白為包被抗原，被檢測樣品D490≥0.176時判定為陽性，否則判定為陰性。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳 M.DL2000 DNA Marker;1.E0基因PCR產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-E0酶切鑒定(A)及重組質(zhì)粒pET-28a-E0酶切鑒定(B) M.DL5000 DNA Marker;1.重組質(zhì)粒XhoⅠ單酶切;2.重組質(zhì)粒EcoRⅠ單酶切;3.重組質(zhì)粒雙酶切;4.質(zhì)粒對照

圖3 重組蛋白表達與純化 M.低分子量蛋白Marker;A.GST-E0重組蛋白表達與純化;A1.IPTG未誘導細菌表達產(chǎn)物;A2.IPTG誘導細菌表達產(chǎn)物;A3.純化后的包涵體沉淀;B.His-E0重組蛋白表達與純化;B1.IPTG未誘導細菌表達產(chǎn)物;B2.IPTG誘導細菌表達產(chǎn)物;B3.純化后的重組蛋白

圖4 Western blot鑒定重組蛋白抗原性 M.蛋白Marker;A1.純化的GST-E0重組蛋白；B1.純化的His-E0重組蛋白

表1 GST-E0重組蛋白最佳包被量與血清最佳稀釋度的確定(D490值)

表2 His-E0重組蛋白最佳包被量最佳包被量與血清最佳稀釋度的確定(D490值)

表3 間接ELISA方法臨界值的確定

2.7 敏感性試驗將陽性血清進行20、40、80、160、320、640、1 280倍稀釋后采用本試驗建立的間接ELISA方法進行檢測。結(jié)果當血清樣品稀釋640倍時，檢測結(jié)果都仍為陽性，表明所建立的豬瘟血清抗體間接ELISA方法具有較好的敏感性。

2.8 特異性試驗以GST-E0和His-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測PRV、PEDV、PCV2、PRRSV、CSFV的陽性血清，結(jié)果只有豬瘟陽性血清檢測為陽性，而PRV、PEDV、PCV2、PRRSV感染后的陽性血清檢測為陰性，表明所建立的間接ELISA方法均具有良好的特異性。

2.9 重復性試驗

2.9.1GST-E0重組蛋白的間接ELISA方法重復性試驗 以GST-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法檢測3份陽性血清和3份陰性血清，根據(jù)測的D490值分別計算板間和板內(nèi)平均值、標準差和變異系數(shù)，結(jié)果見表4和表5，陽性血清和陰性血清的板間變異系數(shù)(CV)為1.72%～4.22%，板內(nèi)重復系數(shù)為1.25%～8.75%，說明該方法具有較好的重復性。

表4 GST-E0重組蛋白的間接ELISA方法板內(nèi)重復性試驗結(jié)果

注：1、2、3為陽性血清樣品，4、5、6為陰性血清樣品。下同

表5 GST-E0重組蛋白的間接ELISA方法板間重復性試驗結(jié)果

2.9.2His-E0重組蛋白的間接ELISA方法重復性試驗 以His-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法檢測3份陽性血清和3份陰性血清，根據(jù)測的D490值分別計算板間和板內(nèi)平均值、標準差和變異系數(shù)，結(jié)果見表6和表7，陽性血清和陰性血清的板間變異系數(shù)(CV)為1.05%～5.44%，板內(nèi)重復系數(shù)為0.71%～3.06%，說明該方法具有較好的重復性。

2.10 間接ELISA與IDEXX試劑盒檢測結(jié)果的比較

2.10.1基于GST-E0重組蛋白的間接ELISA方法與IDEXX E2 血清抗體檢測比較結(jié)果 以GST-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法和IDEXX E2試劑盒平行檢測88份豬血清樣品，結(jié)果見表8。ELISA方法檢測出61份陽性樣品，27份陰性樣品，而IDEXX E2試劑盒檢測出66份陽性樣品，22份陰性樣品，兩者符合率為78.41%。

2.10.2基于His-E0重組蛋白的間接ELISA方法與IDEXX E2 血清抗體檢測比較結(jié)果 以His-E0重組蛋白建立的間接ELISA方法與IDEXX E2試劑盒平行檢測88份豬血清樣品，結(jié)果見表9。間接ELISA方法檢測出68份陽性樣品，20份陰性樣品；而IDEXX E2 試劑盒檢測出66份陽性樣品，22份陰性樣品，兩者總符合率為84.09%。符合率結(jié)果高于2.10.1中的結(jié)果，表明基于His-E0的間接ELISA敏感性高于基于GST-E0的間接ELISA方法。

表6 His-E0重組蛋白的間接ELISA方法板內(nèi)重復性試驗結(jié)果

表7 His-E0重組蛋白的間接ELISA方法板間重復性試驗結(jié)果

表8 基于GST-E0重組蛋白的間接ELISA方法與IDEXX E2 抗體檢測試劑盒比較試驗結(jié)果

表9 基于His-E0重組蛋白的間接ELISA方法與IDEXX E2 試劑盒比較試驗結(jié)果

2.11 基于His-E0的間接ELISA和IDEXX試劑盒與間接免疫熒光(IFA)比較試驗結(jié)果為進一步確證本試驗建立的間接ELISA方法的準確性，選擇His-E0的間接ELISA方法與IFA試驗進行比較，比較結(jié)果見表10和表11。在88份血清樣品中，IFA檢測出74份陽性血清，14份陰性血清；間接ELISA方法檢測出68份陽性樣品，20份陰性樣品，2種方法的總符合率為93.18%。而應用IDEXX E2試劑盒檢測的上述88份樣品中，66份為陽性，22份為陰性，2種方法的檢測結(jié)果符合率為90.91%，表明His-E0間接ELISA方法敏感性稍微高于IDEXX檢測試劑盒。 此外，應用IFA對間接ELISA與IDEXX檢測的差異樣品進行了鑒定。結(jié)果如圖5A所示，以His-E0的間接ELISA檢測為陽性而IDEXX試劑盒檢測為陰性的血清進行IFA，結(jié)果樣品與接毒細胞反應后呈現(xiàn)綠色熒光，表明這部分血清為豬瘟陽性血清；圖5B所示，His-E0間接ELISA檢測為陰性而IDEXX試劑盒檢測為陽性的血清進行IFA檢測，結(jié)果也存在綠色熒光出現(xiàn)，表明本試驗建立的間接ELISA方法與IDEXX試劑盒檢測結(jié)果中都存在部分的假陰性結(jié)果。

表10 基于His-E0重組蛋白的間接ELISA方法與間接免疫熒光(IFA)比較試驗結(jié)果

表11 IDEXX試劑盒與間接免疫熒光(IFA)比較試驗結(jié)果

圖5 間接免疫熒光檢測結(jié)果 A～D.接種豬瘟陽性病毒液；E～H.未接毒的正常細胞；A、E.以間接ELISA檢測為陽性IDEXX試劑盒檢測為陰性的血清樣品；B、F.以間接ELISA檢測為陰性IDEXX試劑盒檢測為陽性的血清樣品；C、G.用豬瘟陽性血清做一抗檢測；D、H.用豬瘟陰性血清做一抗檢測

2.12 某地區(qū)不同種豬群中豬瘟E0抗體的檢測結(jié)果以建立的His-E0間接ELISA方法對江蘇省某地區(qū)豬瘟疫苗免疫的5個種豬群進行檢測，結(jié)果檢測的5個種豬群中，4個種豬群的E0抗體陽性率為100%，1個種豬群的E0抗體陽性率只有50%，表明本試驗建立的間接ELISA方法也可用于豬瘟E2疫苗免疫豬群的免疫效果確定。

3 討論

本試驗應用RT-PCR方法擴增豬瘟E0蛋白基因，并將其克隆到pGEX-4T-1與pET-28a原核表達載體進行重組蛋白的表達。應用表達純化的重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測豬瘟病毒E0抗體的間接ELISA方法。特異性、敏感性和重復性試驗的結(jié)果表明，建立的檢測E0抗體ELISA方法與IDEXX 公司檢測E2抗體的試劑盒具有較好的符合率，符合率可以達到78.41%～84.09%。同時,進行了以豬瘟病毒接毒細胞為抗原的IFA試驗，確定了His-E0 ELISA方法和IDEXX E2 試劑盒檢測結(jié)果的差異樣品的準確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建立的His-E0 ELISA方法與IDEXX E2試劑盒具有相似的準確性，可用于鑒別E2蛋白免疫豬群中的豬瘟野毒感染。

檢測抗體的包被抗原是建立間接ELISA方法的關(guān)鍵。本試驗分別用GST-E0和His-E0的蛋白建立了ELISA方法，研究結(jié)果顯示，與IDEXX E2試劑盒比較，His-E0 作為包被抗原建立的ELISA比GST-E0抗原建立的ELISA方法具有更高的符合率。本試驗純化包涵體形式的蛋白參照先前介紹的方法[22]，包涵體以1.5 mol/L 的尿素反復洗3次后，除去大量的雜蛋白，最終將目的蛋白溶解到8 mol/L 的尿素中。本試驗結(jié)果顯示，基于GST-E0和His-E0重組蛋白作為包被抗原所建立的間接ELISA方法兩者在敏感性，特異性及重復性上沒有明顯差異。 GST-E0和His-E0 ELISA方法與IDEXX E2試劑盒的比對結(jié)果顯示，它們的符合率分別為78.41%和84.09%。同時，His-E0重組蛋白為包被抗原的間接ELISA與IDEXX試劑盒的符合率更高，說明不同表達系統(tǒng)表達同一抗原存在差異，對樣品的檢測結(jié)果有一定的影響，其原因可能是His-E0重組蛋白帶有的His標簽對E0蛋白結(jié)構(gòu)影響小，有利于E0蛋白抗體檢測。吳素麗等[12]利用pET-32原核表達系統(tǒng)建立的豬瘟E0血清抗體間接ELISA與IDEXX試劑盒的符合率為83%，張平[23]利用的畢氏酵母表達系統(tǒng)建立的豬瘟E0血清抗體間接ELISA與IDEXX試劑盒的符合率為80.2%，都明顯低于本試驗利用pET-28a原核表達系統(tǒng)建立的間接ELISA與IDEXX的符合率，說明本試驗所選取的表達系統(tǒng)表達出的重組蛋白對于豬瘟E0抗體的檢測更敏感，也可能本試驗所選取的E0抗原區(qū)的抗原性更好。為進一步驗證本試驗建立的間接ELISA更敏感，本試驗應用了間接免疫熒光試驗對88份血清進行檢測，并分別與基于His-E0的間接ELISA方法和IDEXX試劑盒檢測結(jié)果進行比較，符合率分別為93.18%和90.91%?；贖is-E0的間接ELISA方法的敏感性明顯高于IDEXX試劑盒。從間接免疫熒光檢測的結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)試劑盒檢測為陽性而本試驗所建立的方法檢測為陰性，但經(jīng)過間接免疫熒光檢測為陽性，原因可能是兩者的判定標準上以及血清稀釋倍數(shù)上存在差異，且不同豬體內(nèi)的抗體水平上也存在差異，有的血清樣品本身為弱陽性，在經(jīng)過160倍稀釋后便成為了陰性。而對于本試驗建立的間接ELISA在試劑盒檢測的陰性血清中檢測到的陽性樣品，間接免疫熒光試驗鑒定后為陽性，表明IDEXX試劑盒與本試驗建立的ELISA方法檢測結(jié)果中都存在一些假陰性結(jié)果，因此在臨床樣品檢測中應給予相應的關(guān)注。