孔濤，蔣華，信秀娟，薛壽儒

缺血性腦梗死是老年人失去日常生活能力和死亡的重要原因，其危險(xiǎn)因素包括性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥、高同型半胱氨酸血癥(HHcy)以及不良生活習(xí)慣。HHcy是年輕患者發(fā)生缺血性腦梗死的潛在危險(xiǎn)因素[1]。血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平升高可導(dǎo)致頸動(dòng)脈斑塊形成，增加血管狹窄發(fā)生率和狹窄程度，繼而使缺血性腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高[2-3]。約30%～40%的腦梗死患者存在Hcy水平升高，并且HHcy可能導(dǎo)致腦梗死復(fù)發(fā)[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，HHcy會(huì)加重缺血性腦損傷[5]。許多研究表明，Hcy可能在缺血性腦梗死中起關(guān)鍵作用[6]。本研究探討腦梗死和非腦梗死人群血清Hcy水平在不同性別、高血壓和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因間的差異，以期更有針對(duì)性的篩查HHcy患者，預(yù)防其腦梗死的發(fā)生。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 (1)腦梗死組：選取2017年7月至2019年2月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的新發(fā)缺血性腦梗死患者229例，均符合2014 年《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》中急性缺血性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。男144例，女85例；年齡35～86歲，平均(70.07±11.26)歲。合并高血壓181例。(2)非腦梗死組：系同期住院的非腦梗死患者111例。男61例，女50例；年齡29～85歲，平均(67.59±13.71)歲。合并高血壓56例。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腦出血、惡性腫瘤、靜脈竇血栓、肝腎功能異常、癲癇病史及近期服用葉酸或B族維生素的患者。兩組間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊呋蚣覍賹?duì)本研究?jī)?nèi)容知情，且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清Hcy水平測(cè)定 患者于入院后清晨抽取空腹靜脈血2 ml，0 ℃保存。采用雅培C16000全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清Hcy水平，試劑為美康生物科技的Hcy測(cè)定試劑盒(酶循環(huán)法)及校準(zhǔn)品，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。

1.2.2MTHFR基因檢測(cè) 患者于入院后抽取靜脈全血3 ml置于紫色采血管，經(jīng)基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序等步驟對(duì)MTHFR基因677位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。使用美國(guó)PROMEGA公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA，MTHFR(677)引物：Sense TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA，Anti-sense AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG。50 μl PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃變性2 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物純化后以Sanger測(cè)序法測(cè)序，使用鹽沉淀法將產(chǎn)物DNA從測(cè)序反應(yīng)體系中純化，測(cè)序結(jié)果使用ABI公司的Sequencing Scope 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組與非腦梗死組MTHFR基因多態(tài)性的比較 見表1。腦梗死組與非腦梗死組基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.48，P<0.01)；腦梗死組T等位基因頻率顯著高于非腦梗死組(χ2=4.98，P=0.026)。

表1 腦梗死組與非腦梗死組MTHFR基因型及等位基因頻率的比較組別基因型頻率[例(%)]CCCTTT等位基因頻率(%)CT腦梗死組(n=229)79(34.5)109(47.6)41(17.9)58.341.7非腦梗死組(n=111)60(54.1)42(37.8)9(8.1)73.027.0χ2值13.484.98P值<0.010.026

2.2 不同基因型患者Hcy水平的比較 見表2。腦梗死組不同MTHFR基因型患者Hcy水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.60，P<0.01)；TT基因型患者Hcy水平顯著高于CC和CT基因型的患者(P=0.002，P=0.015)，CC和CT基因型患者Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非腦梗死組不同MTHFR基因型患者Hcy水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.53，P<0.01)；TT基因型患者Hcy水平顯著高于CC和CT基因型的患者(均P<0.01)，CC和CT基因型患者Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腦梗死組CC、CT、TT基因型患者的Hcy水平均顯著高于非腦梗組(t=4.21，P<0.01；t=4.20，P<0.01；t=2.20，P=0.033)。

表2 腦梗死組與非腦梗死組不同基因型患者的Hcy水平(x±s)組別Hcy水平(μmol/L)CCCTTT腦梗死組(n=229)12.79±5.66▲14.95±7.70△24.73±20.71非腦梗死組(n=111)9.49±3.54*▲10.32±5.30*▲16.46±5.73* 注:與腦梗死組比較*P<0.01;與TT基因型比較△P<0.05,▲P<0.01

2.3 高血壓和非高血壓患者Hcy水平的比較 腦梗死組高血壓患者的Hcy水平[(16.88±12.53)μmol/L]顯著高于無(wú)高血壓患者[(12.48±4.93)μmol/L](P<0.01)，非腦梗死組高血壓患者[(11.65±5.83)μmol/L]顯著高于無(wú)高血壓者[(9.07±2.98)μmol/L](P=0.004)。

2.4 不同性別患者Hcy水平的比較 腦梗死組男性患者Hcy水平[(17.76±13.49)μmol/L]顯著高于女性[(12.89±5.81)μmol/L](P<0.01)，非腦梗死組中男性患者Hcy水平[(11.59±5.60)μmol/L]顯著高于女性[(8.88±3.03)μmol/L](P=0.002)。

3 討 論

Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物，其代謝途徑涉及多種代謝酶及輔助因子，其中包括MTHFR基因。MTHFR基因667位C-T常發(fā)生基因突變，編碼的氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，導(dǎo)致MTHFR活性降低[8]。國(guó)內(nèi)研究顯示，C677T純合和雜合突變率分別為23.2%及45.2%，且呈現(xiàn)出一定的地域差異。該位點(diǎn)的純合子突變可使MTHFR基因活性減低50%～60%，導(dǎo)致血清Hcy水平升高[9]。高Hcy可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖、脂質(zhì)代謝異常等，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血管狹窄閉塞等[10]，引起高血壓和腦梗死。本研究顯示，腦梗死組T等位基因頻率(41.7%)顯著高于非腦梗死組(27.0%)，并且具有更高的Hcy水平。腦梗死組基因型為TT患者的Hcy水平顯著高于基因型為CC和CT的患者(P=0.002，P=0.015)。非腦梗死組基因型為TT患者的Hcy水平[(16.46±5.73)μmol/L]顯著高于基因型為CC[(9.49±3.54)μmol/L]和CT[(10.32±5.30)μmol/L]的患者(均P<0.01)。研究結(jié)果和吳子瑜等[8]的研究相同，即腦梗死患者有更高的T等位基因頻率和更高的Hcy水平。

一般認(rèn)為，正常血清Hcy參考范圍為5～15 μmol/L，高于15 μmol/L可定義為HHcy血癥。血清Hcy濃度與血壓水平正相關(guān)[11]。Vayá等[12]認(rèn)為，HHcy可能是隱源性卒中的原因。He等[13]的薈萃分析表明，HHcy組的缺血性腦卒中相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)為低Hcy組的1.69倍。本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死組高血壓患者Hcy水平[(16.88±12.53)μmol/L]顯著高于非高血壓者[(12.48±4.93)μmol/L](P<0.01)，非腦梗死組高血壓患者Hcy水平[(11.65±5.83)μmol/L]同樣顯著高于非高血壓者[(9.07±2.98)μmol/L](P=0.002)，提示Hcy水平與高血壓有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死及非腦梗死患者男性Hcy水平顯著高于女性(均P<0.01)。Hcy水平的性別差異可歸因于女性雌二醇介導(dǎo)的Hcy水平降低。另外，健康的生活習(xí)慣與飲食可以預(yù)防或延緩慢性病的發(fā)展，生理性Hcy水平主要取決于膳食攝入量和維生素狀況[10]。維生素B12和葉酸都是細(xì)胞內(nèi)一碳代謝的重要協(xié)同因子，參與DNA合成、細(xì)胞調(diào)節(jié)過程和氨基酸代謝。老年男性對(duì)健康飲食的認(rèn)識(shí)往往較低，而女性具有更好的健康飲食模式[14]。吸煙也可以導(dǎo)致體內(nèi)B族維生素含量降低，引起Hcy水平升高[15]。這些可能是男性具有更高Hcy水平的原因。

綜上所述，腦梗死患者具有較高的T等位基因頻率，TT基因型、男性、高血壓患者具有較高的Hcy水平。對(duì)TT基因型患者，尤其是合并高血壓的男性患者進(jìn)行Hcy的篩查和定期隨訪，對(duì)于預(yù)測(cè)相關(guān)腦血管事件的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。葉酸和B族維生素治療高Hcy血癥可有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病和卒中。薈萃分析表明，補(bǔ)充葉酸能夠降低11%的卒中風(fēng)險(xiǎn)，而高血壓人群獲益可能更高[16]。因此，老年患者，尤其是患有高血壓的老年男性，更應(yīng)該注意生活飲食習(xí)慣，補(bǔ)充維生素B12和葉酸，并定期檢查血清Hcy水平，TT基因型的患者的MTHFR活性大幅降低，建議使用高劑量的葉酸，并應(yīng)定期檢測(cè)葉酸血清藥物濃度進(jìn)行給藥劑量調(diào)整。