謝紅煉 ，汪漢成，蔡劉體，向立剛, ，史彩華，何永福

1 長江大學農(nóng)學院，湖北省荊州 434025；2 貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；3 長江大學生命科學學院，湖北荊州 434025；4 貴州省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，貴陽 550006

煙草（Nicotiana tabacumL.）是我國重要的經(jīng)濟作物，也是西南地區(qū)煙農(nóng)脫貧致富的主要收入來源。我國煙草的產(chǎn)量和卷煙消費量均占全球市場的40%以上[1]。據(jù)報道，每年我國由煙草侵染性病害造成的損失在7億元以上[2]，其中，真菌性病害占侵染性病害的50%以上[3]。許多病原菌是由種子所攜帶的，病原菌通過附著在種子表面，或以病殘體直接或間接混雜于種子之間，成為重要的病害初侵染源[4]和傳播介體，每克煙草種子表面真菌數(shù)量可達2.0×103～3.8×104個[5]。已報道的煙草種傳病害有：煙草立枯病、煙草炭疽病、煙草赤星病、煙草霜霉病等[6]。

前人利用分離培養(yǎng)的方法報道了煙草種子附生真菌有鏈格孢屬（Alternariasp.）、莖點霉屬（Phomopsissp.）、腐霉屬（Pythiumspp.）、芽枝孢屬（Cladosporiumspp）、曲霉屬（Aspergillussp.）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、青霉菌屬（Penicilliumsp.）、赤霉菌屬（Gibberellasp.）等[7,8,9]。但分離培養(yǎng)存在較大缺陷，僅能獲得部分可培養(yǎng)真菌，且有研究表明純培養(yǎng)獲得的微生物種類只占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%-10%[10]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，Illumina高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境[11,12]、腸道[13,14]、種子[15,16]等領(lǐng)域，但未見用于煙草種子附生微生物的研究。為此，本研究以4個品種的煙草種子（K326、云煙85、301和L8）為材料，采用Illumina高通量測序技術(shù)研究種子附生真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以期指導煙草種子加工工藝。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

K326、云煙85、雪茄煙301及白肋煙L8裸種均由貴州省煙草科學研究院提供，未經(jīng)洗滌，所有種子均于-80℃低溫保藏。稱取各品種裸種100 g，置于盛有250 mL無菌水的三角瓶中，170 r/min搖床震蕩2 h后過濾獲得種子洗滌液。將洗滌液10000 r/min離心10 min，棄除上清液，獲得種子附生微生物樣品，每品種3次重復。

1.2 樣品DNA提取、擴增及測序

取上述種子附生微生物樣品0.50 g，采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（OMEGA）提取樣品DNA，具體步驟按照其操作說明進行。利用NanoDrop 2000檢測抽提DNA濃度和純度，A260/A280值要求在1.8-2.0之間。

1.3 ITS文庫構(gòu)建及高通量測序

以樣品DNA為模板，利用真菌rDNA ITS通用鑒定引物ITS1F （5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R （5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對上述樣品基因組DNA ITS區(qū)域進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（20 μL）： 5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶 0.4 μL，BSA 0.2 μL和 DNA模板10 ng，ddH2O補足至20 μL。將反應(yīng)體系置于ABI Gene Amp? 9700型PCR儀進行擴增，PCR反應(yīng)條件：95℃預變性3 min，35個循環(huán)（95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）回收純化PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina MiSeq測序平臺進行測序，構(gòu)建ITS文庫。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

測序原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接，根據(jù)重疊堿基將兩端序列進行拼接，過濾掉重疊長度小于10 bp或錯配比大于0.2的序列，根據(jù)序列首尾兩端的引物和Barcode區(qū)分樣品并調(diào)整序列方向，允許的Barcode錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2，去除存在模糊堿基的序列，得到優(yōu)化序列。使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），將序列以97%的相似度對進行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類，同時去除單序列和嵌合體，生成OTU表格。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）軟件對序列進行物種注釋，比對Unite（Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php）數(shù)據(jù)庫，比對閾值為70%[17]。

以上述處理后的數(shù)據(jù)計算α多樣性指數(shù)：Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Sobs指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)等，進行α多樣性分析；使用FastTree（version 2.1.3 http://www.microbesonline.org/fasttree/）軟件以最大似然法構(gòu)建進化樹，然后利用FastUniFrac（http://UniFrac.colorado.edu/）軟件得到樣本間距離矩陣并繪制熱圖，進行β多樣性分析；利用R語言進行PCA統(tǒng)計、作圖，通過主成分分析比較樣品間的差異，以此深入了解煙草種子附生真菌群結(jié)構(gòu)與多樣性。以上分析均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger生信云網(wǎng)站平臺（http://www.i-sanger.com/project/index.html）完成[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列測序深度分析

本研究對4組共12個煙草種子樣品進行了測序。利用各樣本在不同測序深度微生物Alpha多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線（圖1），隨著測序數(shù)量的增加，樣本稀釋曲線趨于平緩，當reads數(shù)在2500時，測序數(shù)據(jù)達到飽和，能夠覆蓋微生物群落的絕大部分真菌物種，為此，本次測序的數(shù)據(jù)量滿足后續(xù)分析需求，繼續(xù)增加測序量對樣本信息的貢獻很小。

圖1 稀釋曲線（OTU水平Shannon指數(shù)）Fig.1 Rarefaction curve (Shannon index of OTU level)

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控

本次測序12個樣品，經(jīng)優(yōu)化處理后，共得到高質(zhì)量序列片段434358條，堿基共110915955個，序列平均長度為255 bp。其中，K326、云煙85、301和L8的樣品分別得到112446、111395、103523和106994條高質(zhì)量序列，28283847、27564919、26848028和28219161個堿基，序列平均長度分別為251、247、259、和 264bp。

2.3 OTU聚類分析

在97%相似度水平對樣品序列進行OTU聚類，4個品種的煙草種子附生真菌共鑒定得出5個門、21個綱、43個目、74個科、131個屬、193個種、227個OTUs。其中，K326的3個樣品共鑒定得出3個門、12個綱、24個目、36個科、57個屬、87個種、117個OTUs；云煙85的3個樣品共鑒定得出4個門、19個綱、34個目、60個科、97個屬、135個種、188個OTUs；301的3個樣品共鑒定得出3個門、10個綱、19個目、30個科、46個屬、59個種、76個OTUs；L8的3個樣品共鑒定得出4個門、13個綱、27個目、41個科、60個屬、91個種、114個OTUs（表1）。

表1 4個品種煙草種子附生真菌不同分類水平數(shù)量Tab.1 The total amount of adnascent fungal communities of four varieties tobacco seeds at different taxonomic levels

Venn圖分析結(jié)果表明（圖2），在屬和OTU水平，K326和云煙85附生真菌共有的OTU較多，附生真菌種類較為接近。云煙85的附生真菌種類最多，所含屬和OTU遠高于其他品種，且獨有的OTU和屬也最多。4個品種種子附生真菌群落中共有的OTU和屬的數(shù)量分別為34和24（圖2），其中豐度較高的屬包括：赤霉菌屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬和隱球菌屬（圖5）。

圖2 4 個品種煙草種子附生真菌群落Venn圖Fig.2 Venn diagram of adnascent fungal communities of four varieties tobacco seeds

2.4 附生真菌多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性指數(shù)表（表2）顯示，4個品種種子樣本的覆蓋度指數(shù)（Coverage index）均在0.99以上，表明測序數(shù)據(jù)合理。K326、云煙85、L8種子樣本附生真菌群落豐富度、均勻度、多樣性均高于301種子樣本附生真菌群落豐富度（Simpson指數(shù)越大，樣本的多樣性越低）。在OTU水平的Shannon指數(shù)圖（圖3）表明，K326、云煙85和L8種子附生真菌群落多樣性遠高于301。

表2 4個品種煙草種子附生真菌Alpha多樣性指數(shù)（OTU level）Tab.2 Alpha diversity index of adnascent fungi of four varieties tobacco seeds (OTU level)

圖3 Alpha多樣性指數(shù)（OTU水平Shannon指數(shù)）Fig.3 Alpha diversity index (Shannon index of OTU level)

圖4 4 個品種煙草種子附生真菌在門水平上的相對豐度Fig.4 The relative abundance of adnascent fungi of four varieties tobacco seeds at Phylum level

2.5 附生真菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析

在門水平，K326、云煙85和L8種子附生真菌主要分布在子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），301種子附生真菌主要分布在子囊菌門（Ascomycota）。子囊菌門在K326、云煙85、301和L8附生真菌群落中的占比分別為86.23%、83.70%、99.66%、97.03%；擔子菌門在K326和云煙85樣本的附生真菌群落中的占比超過百分之十（分別為13.70%、16.02%），在301和L8樣本附生真菌群落中較少（占比分別為0.33%、2.95%）。

在屬水平，將占比≥1%的菌屬劃分為優(yōu)勢屬[18-19]，K326附生真菌群落中的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬（Alternaria）（56.83%）、赤霉菌屬（Gibberella）（22.02%）、隱球菌屬（Cryptococcus）（10.72%）、鐮刀菌屬（Fusarium）（3.42%）、紅酵母屬（Rhodotorula）（2.49%）、小畫線殼屬（Monographella）（1.93%），同時該品種還鑒定出大團囊菌屬（Elaphomyces）（0.02%）、Gibellulopsis（0.43%）、屬水平未分類的 核盤 菌科（unclassified_f_Sclerotiniacceae）（0.88%）、屬水平未分類的小戴衛(wèi)霉科（unclassified_f_Davidiellaceae）（0.48%）真菌。云煙85的優(yōu)勢屬為赤霉菌屬（39.24%）、小畫線殼屬（13.49%）、鏈格孢屬（11.82%）、紅酵母屬（10.83%）、鐮刀菌屬（7.50%）、大團囊菌屬（6.11%）、節(jié)擔菌屬（2.41%）、隱球菌屬（2.12%）、曲霉菌屬（Aspergillus）（1.33%）、裂殼菌屬（Schizothecium）（1.17%）、Gibellulopsis（1.11%），同時該品種還鑒定出屬水平未分類的小戴衛(wèi)霉科（0.29%）真菌；301的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬（95.85%），同時該品種還鑒定出赤霉菌屬（0.30%）、鐮刀菌屬（0.95%）、隱球菌屬（0.32%）、小畫線殼屬（0.07%）、屬水平未分類的小戴衛(wèi)霉科（1.36%）和屬水平未分類的核盤菌科真菌（0.40%）。L8的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬（51.06%）、曲霉菌屬（23.22%）、鐮刀菌屬（7.19%）、赤霉菌屬（2.73%）、隱球菌屬（2.68%），同時該品種還鑒定出Gibellulopsis（0.24%）、屬水平未分類的核盤菌科（7.04%）和屬水平未分類的小戴衛(wèi)霉科（3.84%）真菌。

在屬水平上，K326的3個樣品附生真菌群落組成不存在差異性。云煙85中的Y85-3樣品與其它2個樣品存在差異性，主要由于其中存在裂殼菌屬（3.50%）和大團囊屬（18.28%）真菌。301的3個樣品不存在差異性。L8的L8-1樣品與其它2個樣品存在差異性，主要由于其中存在科水平未分類的格孢腔菌目（1.38%）真菌。

圖5 4個品種煙草種子附生真菌在屬水平上的相對豐度Fig.5 The relative abundance of adnsacent fungi of four varieties tobacco seeds at Genus level

本研究選取不同煙草種子樣本豐度高的30個真菌屬繪制豐度熱圖，通過顏色直觀反映了各樣品的豐度前30屬的含量情況。圖6上方的樣本層級聚類樹顯示：每個品種的3個樣品附生真菌群落結(jié)構(gòu)與組成最為相似，都分別單獨聚為一類。由于鏈格孢屬真菌都占有最大比例，K326和301聚為一個分支，L8的3個樣品與該分支類聚。由于云煙85種子的3個樣品中存在最大比例的赤霉屬真菌，因此聚類分支的距離最遠。從整體上來看，大多數(shù)的菌屬在不同樣品中的豐度存在一定的相似性。

2.6 樣本比較分析

樣品距離熱圖（OTU 水平）反映了樣品間附生真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的差異。同一品種的3個樣品真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性基本一致；云煙85的3個樣品與其他品種的9個樣品距離最遠（圖7），表明云煙85種子與其他品種種子樣品間的附生真菌群落結(jié)構(gòu)差異大，K326與301以及L8樣品間的附生真菌群落結(jié)構(gòu)差異小，云煙85與301以及L8樣品間存在較大差異。

基于Bray-Curtis距離的PCoA分析研究了4個品種煙草種子附生真菌群落組成，結(jié)果顯示，第1主成分PC1和第2主成分PC2對樣品的貢獻率分別為70.37%、18.48%，是影響煙草種子附生真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素，且PC1顯著大于PC2。云煙85煙草種子樣品與第1主成分呈正相關(guān)，其他品種煙草種子樣品與第1主成分呈負相關(guān)，L8煙草種子樣品與第2主成分呈正相關(guān)，其他品種煙草種子樣品與第2主成分呈負相關(guān)。在PC1和PC2的作用下，K326和301的距離最近，真菌群落結(jié)構(gòu)差異性最小。

圖6 屬水平下4個品種煙草種子附生真菌的相對豐度熱圖Fig.6 Heat map of the relative abundance of adnascent fungi of four varieties tobacco seeds at genus level

圖7 OTU水平4個品種煙草種子附生真菌距離heatmap圖Fig.7 Distance Heat map of adnascent fungi of four varieties tobacco seeds on OTU level

圖8 OTU水平煙草種子附生真菌主坐標分析Fig.8 Principal coordinate analysis of adnascent fungi of tobacco seeds at OTU level.

3 討論

由于種子附生微生物影響種子質(zhì)量及子代健康，近年備受重視[20]，利用Illumina高通量測序可以獲得更多的微生物信息。本研究中采用的測序平臺和數(shù)據(jù)處理方法與“煙草種子內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性[17]”研究中一致，以期更全面了解煙草種子相關(guān)的微生物。Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，K326、云煙85和L8附生真菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)都高于301。其中，云煙85的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)最高，鑒定出的OTU數(shù)目遠高于其它品種，云煙85附生真菌的種類和數(shù)量最多。由于烤煙品種云煙85和K326為田間收集的裸種，雪茄煙301和白肋煙L8裸種采自溫室大棚，可見真菌群落組成與多樣性與生長環(huán)境存在一定關(guān)系。此外，還與種子的結(jié)構(gòu)等有關(guān)[21-22]。K326和301的附生真菌群落組成均不存在差異性，云煙85和L8中均分別有1個樣品與其它樣品存在差異性，但由豐度熱圖和距離heatmap圖的聚類結(jié)果顯示，每個品種的3個樣品附生真菌群落間的差異性并不顯著，可能是取樣存在的允許誤差。

在門水平，4個品種種子的附生真菌主要分布于子囊菌門和擔子菌門。在屬水平，4個品種鑒定出鏈格孢屬、赤霉菌屬、隱球菌屬、鐮刀菌屬、紅酵母屬、小畫線殼屬、曲霉菌屬及Gibellulopsis屬真菌，其中，共同菌屬為鏈格孢屬、赤霉菌屬、隱球菌屬、鐮刀菌屬。據(jù)報道，鏈格孢菌可引起煙草赤星病[23]，鐮刀菌可引起煙草枯萎病和根腐病[24]，曲霉菌可引起煙草儲存期病害[25]，核盤菌可引起植物菌核病[26]。以上有害真菌會侵染種子或者煙苗，在烤煙種子加工過程中有必要對種子進行消毒處理。赤霉菌分泌的赤霉素可以促進種子的萌發(fā)以及植株的生長[27]，因此，可以考慮在包衣劑中添加赤霉素類植物生長素，提高種子的發(fā)芽率。

除已有研究中存在的菌屬之外，還鑒定其他種類的菌，如隱球菌屬、紅酵母屬、小畫線殼屬、大團囊菌屬、裂殼菌屬、節(jié)擔菌屬和Gibellulopsis屬真菌。隱球菌屬、紅酵母屬、小畫線殼屬和大團囊菌屬真菌環(huán)境中常見真菌[28-30]，目前未見為害煙草的報道。云煙85種子鑒定出節(jié)擔菌和Gibellulopsis屬真菌。節(jié)擔菌又稱噬干菌（xerophile），會引起低水分食物霉變[31]，其對大麗花輪枝孢（Verticillium dahliae）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）有很強的抑制作用，并且在YG培養(yǎng)基上生長的菌絲具有較高的核糖核酸酶活性[32]，Gibellulopsis屬真菌是菊科植物和生菜的病原菌，尤其在苗期[33-35]。為此，節(jié)擔菌和Gibellulopsis屬真菌是否會侵染煙草有待進一步研究。