羅金定，伍 迪，呂慧婕，何劍琴，楊絲絲，奉水東，凌宏艷△

(1.南華大學(xué)生理學(xué)教研室，2.南華大學(xué)社會(huì)醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生事業(yè)管理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001)

目前全世界肥胖及超重的人數(shù)已達(dá)21億，接近全世界總?cè)丝诘?0%，而中國已成為世界的第二大“肥胖國”[1]，其肥胖人數(shù)僅次于美國[2]。因此，肥胖問題亟待解決。

肥胖的主要原因是能量攝入大于能量消耗，從而造成脂肪在體內(nèi)積聚過多[3]。目前人們普遍認(rèn)為，人體內(nèi)有兩種脂肪組織，包括棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)和白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)。白色脂肪組織能夠以甘油三酯的形式儲(chǔ)存能量，當(dāng)能量過剩時(shí)便可引起白色脂肪過度沉積導(dǎo)致超重和肥胖。隨著對(duì)脂肪組織研究的深入，發(fā)現(xiàn)WAT在一定條件下可誘導(dǎo)成為米色脂肪細(xì)胞，這種類型的脂肪細(xì)胞具有與棕色脂肪細(xì)胞相似的功能，這種現(xiàn)象稱為WAT棕色化[4]。BAT細(xì)胞內(nèi)存在許多線粒體，線粒體膜上存在大量解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein 1,UCP1)，UCP1是棕色脂肪內(nèi)的特異性蛋白，這種物質(zhì)可將葡萄糖和脂肪酸分解產(chǎn)生的能量以熱量的形式釋放,所以棕色脂肪具有抵抗肥胖的作用[5]。誘導(dǎo)WAT棕色化可能成為肥胖新的治療方法。

目前對(duì)肥胖的治療主要是改變生活方式、藥物和手術(shù)治療[6]。改變生活方式常常由于病人無法堅(jiān)持而失敗[7]，手術(shù)治療存在極大的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，而藥物治療雖然在一定程度上可靠，但由于其毒副作用較大限制其使用[8]。因此，尋找安全、毒副作用少的減肥藥物一直是科學(xué)家們的追求。

二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)為黃酮類化合物，具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、改善糖脂代謝及胰島素抵抗等作用[9-11]。然而，DHM 是否能促進(jìn)白色脂肪組織棕色化、抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究采用高脂飲食建立小鼠肥胖模型，用DHM處理，觀察DHM對(duì)肥胖小鼠的影響并探討其機(jī)制是否與促進(jìn)WAT棕色化有關(guān)，旨在為肥胖的治療提供有價(jià)值的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開發(fā)新的防治肥胖的藥物提供重要的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57bl/6j雄性小鼠，3～4周齡，體重為16～19 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK(湘)2013-0004，小鼠在南華大學(xué)動(dòng)物房(3～5只一籠)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，正式開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物房12 h明暗交替；環(huán)境溫度為23 ～24℃，濕度為40% ～60%，保證小鼠充足的鼠糧和飲用水，實(shí)驗(yàn)操作遵照美國國立衛(wèi)生研究院 NIH 的《國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

1.2 二氫楊梅素溶液的配制

二氫楊梅素(DHM)由張家界志誠生物科技有限公司提供。將雙蒸水置于70℃的恒溫水浴箱中加熱，20 min后，將一定量的二氫楊梅素溶解在已經(jīng)加熱好的雙蒸水中，并用玻璃棒攪拌均勻。

1.3 肥胖小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

60只C57bl/6j雄性小鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，采用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)分別用或不用低、高劑量的DHM(125 mg/(kg·d)和250 mg/(kg·d))灌胃處理16周，因此，實(shí)驗(yàn)共分成6組(n=10)：正常對(duì)照組(ND組)、正常對(duì)照+低劑量二氫楊梅素組(ND+L-DHM組)、正常對(duì)照+高劑量二氫楊梅素組(ND+H-DHM組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+低劑量二氫楊梅素組(HFD+L-DHM組)、高脂飲食+高劑量二氫楊梅素組(HFD+H-DHM組)。實(shí)驗(yàn)期間，每4周測一次小鼠體重。16周末，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重比普通飼料喂養(yǎng)的小鼠體重高20%，視為肥胖小鼠模型建立成功。

1.4 空腹血糖、Lee's指數(shù)、體脂重量和血脂的測量

16周末，小鼠禁食過夜，稱重后剪尾取血，用儀成血糖儀測小鼠的空腹血糖。隨后眼眶靜脈取血，離心取上清液，采用生化分析儀測小鼠血脂(總膽固醇，高密度脂蛋白和甘油三酯)。最后將小鼠脫頸椎處死，量取小鼠體長(從小鼠鼻尖到肛門的距離)，根據(jù)公式計(jì)算Lee's指數(shù)=體重(g)^(1/3)/體長(cm)。取肩胛下，附睪和腹股溝的脂肪組織稱重后保留備用。

1.5 脂肪組織HE染色及大小測定

取上述3個(gè)部位的脂肪組織，置于4℃磷酸緩沖液(0.01 mmol/L PBS，pH=7.3)中洗去血液，在10%甲醛溶液中固定脫水后、浸蠟、包埋、切片、蘇木素染色液染色、于200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇4個(gè)視野進(jìn)行觀察。用Image Pro-Plus軟件計(jì)數(shù)單個(gè)視野(20×10)中脂肪細(xì)胞數(shù)目，算出脂肪細(xì)胞的平均面積值，每個(gè)標(biāo)本測量4個(gè)視野區(qū)，取算術(shù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 免疫組化檢測脂肪組織UCP1的表達(dá)

將組織切片在55℃～60℃溫箱中過夜后，抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，滴加兔抗小鼠UCP1一抗(Abcam公司)，4℃過夜。PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，37℃孵育10 min后，PBS洗3次，每次5 min；最后滴2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察掌握顯色時(shí)間。最后自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，將制好的切片放置在顯微鏡下觀察。用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件，選取棕黃色著色為陽性著色。分析陽性表達(dá)處的積分光密度值算出平均光密度值(average optical density value，AOD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 DHM對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體重的影響

如表1所示：與ND組相比，c57bl/6j小鼠經(jīng)高脂飼料處理16周后，體重顯著增加，提示肥胖小鼠模型復(fù)制成功。與HFD組相比較，HFD+L-DHM組和HFD+H-DHM組小鼠從第8周開始體重降低，提示DHM可降低肥胖小鼠的體重，但DHM對(duì)正常小鼠體重?zé)o明顯影響。

Tab. 1 Effects of dihydromyricetin(DHM)on the body weight of c57bl/6j mice fed with high fat diet(g, n=10)

ND: Normal control; HFD: High-fat diet

*P<0.05vsND group；#P<0.05vsHFD

2.2 DHM對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠體脂重量、血糖、Lee's指數(shù)的影響

如表2所示：與ND相比，HFD組脂肪重量、血糖和Lee's指數(shù)顯著增高，用高劑量或低劑量DHM能顯著降低HFD小鼠脂肪重量、血糖和Lee's指數(shù)；而ND，ND+L-DHM，ND+H-DHM三組小鼠上述指標(biāo)無明顯差異。提示DHM可降低高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠體脂、改善糖代謝紊亂，但對(duì)正常小鼠無明顯影響。

GroupDHM(mg/(kg·d))Fatweight(g)Bloodglucose(mmol/L)Lee’sindexND---0.99±0.244.8±0.3343.5ND+L-DHM1250.85±0.154.5±0.2336.7ND+H-DHM2500.78±0.144.6±0.5335.9HFD---2.37±0.73?6.3±0.1?369.4?HFD+L-DHM1251.14±0.66#5.1±0.3#331.3#HFD+H-DHM2501.077±0.2#5.2±0.2#337.2#

*P<0.05vsND group；#P<0.05vsHFD

2.3 DHM對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠血脂的影響

如表3所示：與ND相比，HFD組血清總膽固醇(plasma total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride ,TG)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)顯著升高；而HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組血脂顯著低于HFD組；ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM三組血脂無明顯差異；提示DHM可降低高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠TC、TG和HDL-C，但對(duì)正常小鼠無顯著影響。

GroupDHM(mg/(kg·d))TCTGHDL-CND---2.37±0.060.75±0.231.42±0.11ND+L-DHM1252.06±0.030.72±0.411.31±0.22ND+H-DHM2501.97±0.150.70±0.221.40±0.03HFD---4.28±0.18?1.42±0.58?1.95±0.08?HFD+L-DHM1252.58±0.43#1.15±0.21#1.39±0.19#HFD+H-DHM2502.53±0.26#0.9±0.33#1.40±0.22#

*P<0.05vsND group；#P<0.05vsHFD

2.4 DHM對(duì)肥胖小鼠脂肪組織脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果及表4顯示：HFD組附睪處(圖1)、腹股溝處(圖2)、肩胛下(圖3)脂肪細(xì)胞的直徑顯著大于正常對(duì)照組，而經(jīng)L-DHM或H-DHM處理的HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠上述3處脂肪組織脂肪細(xì)胞顯著變小，但DHM對(duì)正常小鼠脂肪細(xì)胞大小無顯著影響。提示：DHM可限制高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖小鼠白色脂肪組織脂肪細(xì)胞變大。

Fig. 1 Dihydromyricetin reduced the size of adipocytes in the epididymis of obese mice induced by high-fat diet(HE staining ×200)

Fig. 2 Dihydromyricetin reduced the size of fat cells in the inguinal region of obese mice induced by high-fat diet(HE staining ×200)

Fig. 3 Dihydromyricetin reduced the size of subscapular fat cells in obese mice induced by high fat diet(HE staining ×200)

GroupDHM(mg/(kg·d))Epididymaladiposecellsize(μm2)Inguinaladiposecellsize(μm2)Subscapularadiposecellsize(μm2)ND---1099±255660±132436±90ND+L-DHM1251102±261712±129415±87ND+H-DHM2501045±250675±125409±92HFD---8543±868?7595±779?5961±1049?HFD+L-DHM1251633±658#1087±312#1040±25#HFD+H-DHM250857±257#462±42#681±40#

*P<0.05vsND group；#P<0.05vsHFD

2.5 DHM對(duì)肥胖小鼠脂肪組織棕色化功能蛋白UCP1的表達(dá)的影響

線粒體解偶聯(lián)蛋白-1(UCP1)在棕色脂肪組織含量豐富，脂肪組織中線粒體UCP1的表達(dá)增加可反映WAT棕色化增加。因此，本研究應(yīng)用免疫組化檢測上述3種脂肪組織中UCP1的表達(dá)。結(jié)果如圖4～6及表5所示：與ND組相比較，HFD附睪處(圖4)、腹股溝處(圖5)、肩胛下(圖6)脂肪細(xì)胞中UCP1的平均光密度值(AOD)升高，而與HFD組相比較，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組脂肪細(xì)胞的UCP1的AOD顯著升高，但ND組，ND+L-DHM組和ND+H-DHM組間UCP1的AOD無顯著差異。提示：DHM可上調(diào)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠UCP1的表達(dá)促進(jìn)WAT棕色化。

Fig. 4 Dihydromyricetin increased the expression of UCP1 in the epididymis of obese mice induced by high fat diet(IHC staining ×200)

Fig. 5 Dihydromyricetin increased the expression of UCP1 in the inguinal region of obese mice induced by high fat diet(IHC staining ×200)

Fig. 6 Dihydromyricetin increased the expression of UCP1 in the shoulder of obese mice induced by high fat diet(IHC staining ×200)

3 討論

隨著生活水平的提高，生活方式的改變，肥胖人群越來越多。肥胖不僅影響人們的自信心，還導(dǎo)致許多與肥胖密切相關(guān)的疾病，如糖尿病、心血管疾病等，給家庭及社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，肥胖已經(jīng)成為世界性亟待解決的問題[12]。目前認(rèn)為，WAT的蓄積是肥胖的主要原因，BAT通過線粒體氧化和UCP1消耗體內(nèi)儲(chǔ)存的脂質(zhì)并產(chǎn)熱。BAT隨著年齡的增長越來越少，但在反復(fù)冷刺激的情況下可以增加BAT的活性同時(shí)減少體脂含量[13]。Lo等綜述詳細(xì)探討了：誘導(dǎo)小鼠或蝙蝠WAT棕色化可降低動(dòng)物體重、減少肥胖的發(fā)生[14]；Suarez-Zamorano等研究發(fā)現(xiàn)，抗生素處理的瘦素缺乏癥小鼠和高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠，促進(jìn)WAT棕色化可減輕動(dòng)物體重、減輕肥胖[15]。提示：誘導(dǎo)WAT棕色化可作為治療肥胖的新方法。

GroupDHM(mg/(kg·d))AODofUCP1intheepididymisAODofUCP1intheinguinalAODofUCP1inthesubscapularND---0.0015±0.00040.0011±0.00020.0084±0.0005ND+L-DHM1250.0008±0.00010.0007±0.00020.0028±0.0009ND+H-DHM2500.0010±0.00020.0014±0.00030.0127±0.0017HFD---0.0064±0.0004?0.0073±0.0002?0.0128±0.0002?HFD+L-DHM1250.0150±0.0021#0.0148±0.0046#0.0082±0.0001HFD+H-DHM2500.0287±0.0027#0.0208±0.0061#0.0217±0.0060#

*P<0.05vsND group；#P<0.05vsHFD

目前，市場上缺乏安全有效的減肥藥。而中藥以其來源廣泛，易于取得，低毒副作用而深受大家的喜愛，我們期望能從中藥中找到控制肥胖且毒副作用小的藥物。二氫楊梅素(DHM)為藤類植物提取的黃酮類化合物，在糖尿病、腫瘤、炎癥等領(lǐng)域具有積極作用。我們課題組前期的研究證實(shí)DHM可改善2型糖尿病小鼠認(rèn)知功能障礙[16]，但DHM是否能影響肥胖，還未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)使用高脂飲食建立肥胖小鼠模型，觀察DHM是否可抑制小鼠肥胖并初步探討其作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，L-DHM和H-DHM能顯著降低肥胖小鼠的體重、脂肪重量及脂肪細(xì)胞大小、Lee's指數(shù)、血糖和血脂水平；但L-DHM+HFD組和H-DHM+HFD上述指標(biāo)無顯著差異，同時(shí)DHM對(duì)正常小鼠上述指標(biāo)也無顯著影響，提示無論是L-DHM還是H-DHM均可減少脂肪的蓄積，改善糖脂代謝紊亂，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖。那么，DHM抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖的機(jī)制是什么呢?

本室在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DHM處理的2型糖尿病小鼠皮下脂肪組織出現(xiàn)棕色化改變；近來也有文獻(xiàn)報(bào)道京尼平通過上調(diào)UCP1的表達(dá)促進(jìn)BAT活化和WAT棕色化，從而達(dá)到減輕體重的效果[17]。另文獻(xiàn)報(bào)道：DHM可經(jīng)過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1 α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactiva-tor-1 α, PGC1a)信號(hào)通路提高小鼠骨骼肌胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗[18]。而PGC1α是涉及WAT棕色化過程的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)UCP1的表達(dá)。因此我們猜測：DHM可能通過促進(jìn)WAT棕色化抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。為證實(shí)這一猜想，我們采用免疫組化檢測各組小鼠附睪、腹股溝和肩胛下脂肪組織中棕色化功能蛋白UCP1的表達(dá)。結(jié)果顯示：DHM可顯著增加HFD組小鼠肩胛下，腹股溝和附睪處脂肪組織的棕色化因子UCP1的表達(dá)，但對(duì)正常小鼠上述3種脂肪組織中UCP1的表達(dá)無顯著影響。提示DHM可以上調(diào)UCP1的表達(dá)促進(jìn)肥胖小鼠WAT棕色化，增加白色脂肪的分解從而達(dá)到減肥的效果。但DHM具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。