陳功軒，王 杏，張洪權(quán)，鄧櫻花*

(1.湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430205；2.湖北第二師范學(xué)院植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點實驗室，武漢 430205)

綠豆芽含有豐富的營養(yǎng)成分，例如維生素C、B、A、E及多種礦質(zhì)元素，其中維生素B17是較強的抗癌物質(zhì)，經(jīng)常食用芽菜能有效防治高血壓、糖尿病、高膽固醇、胃癌及直腸癌等多種疾病[1-2].綠豆芽因營養(yǎng)價值高，為廣大消費者所喜愛，市場需求量極大.

研究表明，萘乙酸(NAA)是一種廣譜型植物生長外源性調(diào)節(jié)劑，機理上NAA能顯著促進內(nèi)源性生長素生成及代謝[3-4].生長素參與植物生長發(fā)育的各個階段，它們可能在極低的濃度條件下調(diào)節(jié)細胞的伸長、分裂，組織腫脹，不定根的形成，胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)以及促進細胞壁的松弛等[5].因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為加快種子發(fā)芽，植株生長，有人將NAA應(yīng)用于種子萌發(fā)和生長的各個階段.但是NAA對人畜是有低毒性的，大鼠急性口服LD50為1 000～5 900 mg·kg-1，對皮膚和粘膜有刺激作用.因此從食品安全的角度看，尋找一種靈敏度高、專一性強、操作簡便的定性定量分析NAA殘留的方法具有重要意義.

目前，NAA的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、液相—質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、氣相色譜法[8]、氣相—質(zhì)譜聯(lián)用法[9]等多種方法.高效液相色譜法具有專一性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好和操作簡便等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于NAA的測定[10-12].

本文以市場上出售的普通綠豆為試材，發(fā)芽后測定不同濃度NAA處理下的胚根、下胚軸和子葉等部位維生素C含量，初步探討不同濃度NAA對綠豆芽維生素C的影響，旨在為綠豆芽生產(chǎn)選擇最適濃度的生長調(diào)節(jié)劑提供一定的參考價值.此外，采用高效液相色譜法，對綠豆芽中NAA的殘留做進一步分析測定.

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

萘乙酸(NAA)、磷酸、可溶性淀粉、碘酸鉀、碘化鉀、氫氧化鈉等均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇(HPLC級)購自Tedia (Tedia Chemical,USA).

Agilent1260高效液相色譜儀(配四元泵、在線脫氣和紫外檢測器)、BD-FYX種子發(fā)芽箱(南京貝蒂實驗儀器有限公司)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210(瑞士步琦有限公司)、Eppendorf高速離心機5840R(恒科貿(mào)易)、ME104E 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)和FE28 pH計(梅特勒-托利多有限公司).實驗中所用水為超純水(Millipore,Bedford,MA,USA).

NAA培養(yǎng)液的配制：準(zhǔn)確稱量一定量NAA，用少量酒精溶解，再用超純水配制濃度為1×10-5mol·L-1的NAA培養(yǎng)液，再逐步稀釋成1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol·L-1的NAA培養(yǎng)液，共5個濃度.

NAA標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：稱取NAA 適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成250 μg·mL-1的儲備液；然后將儲備液稀釋成為0.50～30.00 μg·mL-1的NAA標(biāo)準(zhǔn)工作液系列，低溫避光保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)芽試驗 挑選外表無殘缺、健康、發(fā)芽勢好、發(fā)芽率高的200粒新鮮綠豆六組.取6個培養(yǎng)皿編號1、2、3、4、5、6，用酒精擦拭消毒，1到5號培養(yǎng)皿分別依次加入10 mL的1.9 μg·mL-1、1.9×10-1μg·mL-1、1.9×10-2μg·mL-1、1.9×10-3μg·mL-1、1.9×10-4μg·mL-1NAA 培養(yǎng)液和200粒綠豆，6號培養(yǎng)皿中加入10 mL超純水和200粒綠豆作為對照.放入種子發(fā)芽箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度設(shè)為25 ℃，無光照.每天9∶00、14∶00、19∶00分別在6個培養(yǎng)皿中定時澆自來水30 mL.

1.2.2 維生素C(Vc)含量的分析(碘量法) 樣品提?。涸谂囵B(yǎng)的第7 d，將用NAA溶液處理過并發(fā)芽且長勢一致、性狀穩(wěn)定的綠豆芽依次按從小到大的濃度選取足夠量作為實驗材料.然后用天平稱取0.5 g綠豆芽的子葉各三份放入研缽中，充分研磨勻漿，分別移取2%的鹽酸4 mL沖洗研缽加入10 mL離心管中，搖勻，放入離心機離心轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1，溫度為4 ℃，時間15 min，取上清液為提取液[13].

滴定：在三角瓶中，用移液管中注入1% KI液0.50 mL、0.5% 淀粉液1.00 mL、樣品提取液5.00 mL、蒸餾水3.50 mL.用0.000 167 mol·L-1碘酸鉀滴定，緩慢加入并搖動三角瓶.至溶液顏色為微藍色，半分鐘不褪色.記錄消耗碘酸鉀的毫升數(shù).另空白對照組加入1% KI液0.50 mL、0.5% 淀粉液1.00 mL、2% 鹽酸5.00 mL、蒸餾水3.50 mL[14].

以相同方法測量綠豆芽下胚軸、胚根中Vc含量.

1.2.3 色譜分析方法

1) 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱(4.6×150 mm,5 μm);流動相：A為甲醇、B為磷酸-氫氧化鈉緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH=3.0);流動相比例A%∶B%=70∶30，等度洗脫;柱溫：40 ℃;檢測波長為220 nm;流速1.0 mL·min-1;進樣量20 μL.

2) 樣品處理

參考文獻[15]的樣品處理方法,在培養(yǎng)的第8天，選取培養(yǎng)的長勢正常、性狀完整的豆芽，純水潤洗三次再用濾紙吸干,準(zhǔn)確稱取20.0 g,切碎后將樣品研磨成勻漿,加入60 mL預(yù)冷(-20 ℃)的80%甲醇溶液，勻漿液在常溫下(不超過25 ℃)超聲震蕩30 min，然后在4 ℃、4 000 r·min-1的條件下離心15 min.抽濾，將濾液轉(zhuǎn)至旋蒸瓶內(nèi)，減壓蒸發(fā)濃縮至約10 mL水溶液.

將減壓濃縮后的水溶液用2.0 mol·L-1HCl調(diào)pH至2.5～2.9，溶液轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗，加入相同體積的乙酸乙酯萃取2～3次.NAA在此條件下完全溶于乙酸乙酯溶液中.合并上層乙酸乙酯相，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)(38 ℃)至干，用純甲醇溶解后定容至10 mL進行HPLC分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度NAA對綠豆芽Vc含量的影響

用碘量法對綠豆芽胚根、下胚軸、子葉等部位所含VC的量進行測量，對比施加NAA培養(yǎng)液和空白組，分析NAA對綠豆芽品質(zhì)的影響.測量結(jié)果見表1.

表1 綠豆芽中各部位Vc含量Tab.1 Vc content in different parts of mungbean sprouts

由表1可知，在培養(yǎng)綠豆芽過程中，不同濃度的NAA培養(yǎng)液對豆芽品質(zhì)有一定的影響.從下胚軸來看，當(dāng)NAA濃度為1.9×10-1μg·mL-1時，Vc含量為NAA空白培養(yǎng)液的2倍以上(p<0.05).從子葉來看，當(dāng)NAA濃度為1.9 μg·mL-1、1.9×10-1μg·mL-1時Vc含量均較高，其含量為空白的2.5至3 倍左右(p<0.05).綜合比較，認(rèn)為采用較低濃度而非高濃度NAA培養(yǎng)液，如1.9×10-1μg·mL-1，即能促進綠豆發(fā)芽成根，及提升綠豆芽中Vc含量，這與文獻[16-17]吻合.

2.2 NAA分析色譜條件的建立

2.2.1 最大吸收波長的確定 在190～400 nm紫外波長范圍內(nèi)對NAA的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行掃描，如圖1所示.從圖中可見，NAA的最大吸收波長為220 nm.后續(xù)NAA殘留分析中，紫外檢測波長選擇在220 nm.

2.2.2 流動相的選擇 分別采用45%、55%、65%、70%、75%含量的甲醇作為流動相，考察其對NAA保留時間的影響.當(dāng)甲醇含量為45% 的時候，NAA保留時間為13.22 min，如圖2所示，時間較長.隨著甲醇含量提高，NAA保留時間變短，當(dāng)甲醇含量為70%的時候，NAA保留時間2.76 min，時間較短，如圖3所示.當(dāng)甲醇含量繼續(xù)提高到75%時，NAA與雜質(zhì)峰沒有達到基線分離.因此實驗中選用70%甲醇，30%磷酸緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH=3.0)為最合適的流動相.

圖1 NAA紫外吸收光譜圖Fig.1 The ultraviolet absorption spectrum of NAA

圖2 流動相中甲醇含量為45% NAA的色譜圖Fig.2 Chromatogram of NAA when the methanol content is 45% in mobile phase

圖3 流動相中甲醇含量為70% NAA的色譜圖Fig.3 Chromatogram of NAA when the methanol content is 70% in mobile phase

2.2.3 柱溫的選擇 柱溫對物質(zhì)的分離具有重要的影響，柱溫過高會使分離對象的擴散速度加快，分離時間縮短；柱溫過低，降低擴散速度和分離效能，同時出現(xiàn)峰形變寬等現(xiàn)象[10].實驗中，考察了不同的柱溫對NAA分離的影響，結(jié)果表明當(dāng)柱溫為30 ℃和35 ℃時，峰形較寬，保留時間較長；當(dāng)柱溫超過40 ℃時，NAA與雜質(zhì)峰沒有達到基線分離.最后選擇的柱溫是40 ℃.

2.3 NAA檢測方法學(xué)的考察

2.3.1 NAA線性范圍與檢出限 配制0.50、1.00、3.75、7.50、15.00和30.00 μg·mL-1的NAA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.3色譜條件”進行測定，繪制樣品濃度(橫坐標(biāo)X，μg·mL-1)與峰面積(縱坐標(biāo)Y，mV·s)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸分析，且當(dāng)信噪比為3(S/N=3)時，該方法對NAA的最低檢出限(LOD)為0.01 μg·mL-1.對30.00 μg·mL-1的NAA溶液進行5次重復(fù)實驗，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.19%.分析結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明方法在0.50～30.00 μg·mL-1線性范圍內(nèi)，線性良好，精密度較高.

表2 線性范圍及檢出限Tab.2 The linear range and limit of detection

2.3.2 NAA樣品加標(biāo)回收率和精密度 本實驗中樣品均來自于實驗室自發(fā)的綠豆芽.在綠豆芽的成熟期(8 d)后進行樣品添加回收測定，分別加入1.00、7.50、15.00 μg·mL-1的NAA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.3所述對樣品進行前處理操作后，進行色譜測定，實驗結(jié)果如圖4所示.為了考察方法的精密度，對每一添加濃度樣品重復(fù)測定5次.結(jié)果表明：NAA的加標(biāo)回收率在100.2%～110.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.90%～3.89%之間，方法的回收率和重現(xiàn)性均較好.所得結(jié)果見表3.

A) 綠豆芽空白樣品；B) 樣品添加15.00 μg·mL-1 NAA標(biāo)準(zhǔn)溶液A) control sample;B) mungbean sprout sample with 15.00 μg·mL-1 NAA圖4 綠豆芽樣品色譜圖Fig.4 Chromatograms of the mungbean sprout samples

表3 方法加標(biāo)回收率及精密度Tab.3 Standard recovery rate and precision

2.4 樣品中NAA殘留量的分析

在綠豆芽的成熟期(8 d)后按照1.2.3所述進行前處理后，采用建立的分析方法對NAA溶液培養(yǎng)的綠豆芽中的NAA殘留量進行分析，所得結(jié)果如表4所示.

從表中可見，培養(yǎng)皿中添加一定濃度的NAA后，綠豆芽中的NAA殘留量均高于空白對照組.但可以看到，在測試的NAA培養(yǎng)液的濃度范圍內(nèi)(1.9 μg·mL-1及以下)，綠豆芽中的NAA含量不超過0.041 μg·g-1.根據(jù)我國《GB2763-2012食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定萘乙酸的限量為0.1 mg·kg-1[18]，說明本實驗選取的NAA培養(yǎng)基濃度可安全地用于綠豆芽生產(chǎn)過程而不會導(dǎo)致殘留問題.

表4 綠豆芽中的NAA殘留量Tab.4 Residues of NAA in mungbean sprout

3 結(jié)論

本文選用對照培養(yǎng)的方法，比較探究NAA對綠豆芽中Vc的代謝影響，實驗結(jié)果表明NAA培養(yǎng)液濃度為1.9×10-1μg·mL-1時，綠豆芽中Vc含量最高，這可為綠豆芽的培養(yǎng)選擇最適濃度的生長調(diào)節(jié)劑提供一定的指導(dǎo)價值.而且，本研究表明NAA對于綠豆芽生根及發(fā)芽具有促進作用，并發(fā)現(xiàn)對營養(yǎng)成分如Vc在綠豆芽不同部位分布具有一定的影響.研究探索NAA與內(nèi)源性生長素如吲哚-3-乙酸的代謝和分布關(guān)系，具有一定的科學(xué)實用價值，也是將來可能的研究方向.

此外，本文建立了一種分析綠豆芽中NAA殘留的方法，流動相為甲醇和磷酸-氫氧化鈉緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH=3.0)(70∶30，V/V)組成，柱溫為40 ℃，紫外檢測波長220 nm.該方法的線性關(guān)系良好，檢出限較低、精密度好、回收率比較理想.所建立的綠豆芽中植物激素殘留的測定方法滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中植物激素殘留測定的要求，可提供給相關(guān)部門用于對農(nóng)產(chǎn)品和食品的質(zhì)量監(jiān)控.