仇笑笑

（山西醫(yī)科大學晉祠學院，山西太原 030025）

臨床中沙門菌是一種廣泛分布在自然界中的革蘭氏陰性桿菌，可導致貝類、羊、豬、雞、鴨等多種動物和人患病[1]。目前多采用抗生素抑制沙門菌增殖，但近年來隨著抗生素藥品的濫用，沙門菌耐藥性顯著提升，給國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。同時，沙門菌作為一種常見的食源性致病菌，對人類身體健康也產(chǎn)生了一定程度的影響[2]。臨床中噬菌體能夠特異性侵染細菌，通過自身特定配體同細菌表層特定受體相結合的途徑裂解細菌，從而抑制病菌增殖，且沙門菌噬菌體僅會影響沙門菌合成，并不會對正常菌群產(chǎn)生不良影響，不受細菌耐藥性的制約，屬于天然、安全的抑菌劑[3-4]。為了探討抗沙門菌的有效方法，利用噬菌體治療細菌感染，就沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定與生物學特性進行如下探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選自臨病死雞中分離出的沙門氏菌菌株，墊料、糞便均源于山西省尖草坪區(qū)、長子縣、高平市、臨猗縣和壺關縣等地商品肉雞場。

日立Hitachi H-9500透射電子顯微鏡；LB培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋公司；Beckman Coulter Avanti J-26S離心機；蘇瑞電子設備(北京)有限公司提供的DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；Millex-GV SLGVX13NL 1000細菌過濾器；上海知楚儀器有限公司提供的ZQZY-88BV型全溫振蕩培養(yǎng)箱。全部研究材料和用品均處于有效期內(nèi)，器械性能正常。

1.2 方法

1.2.1 處理樣本

采集雞糞和墊料30 g，加入200 mL無菌生理鹽水內(nèi)，確保浸泡充分，自然沉降240 min后取上清液，12000 r/min離心處理15 min，再使用濾器過濾（0.22 μm），以濾液作為分離噬菌體的母液。

1.2.2 菌種復蘇與菌懸液制備

復蘇冷凍保存的沙門菌，挑取生長菌落轉(zhuǎn)移至LB肉湯內(nèi)，放置在全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備好菌懸液，備用。

1.2.3 采用雙層平板法分離噬菌體

在操作過程中取1.2.1中的母液3 mL和增殖后的沙門菌菌懸液200 μL，均勻混合，震蕩培養(yǎng)，維持溫度37 ℃，過夜后采集培養(yǎng)后的增殖液在10 000 r/min條件下進行離心處理5 min，再使用細菌濾器（0.22 μm）進行過濾處理。取濾液200 μL與菌懸液100 μL均勻混合后，放置在37 ℃溫箱內(nèi)孵育5 min。將混合液添加至融化后冷卻到45 ℃左右的含瓊脂（0.7%）LB上層瓊脂內(nèi)，均勻混合，將上層瓊脂倒進下層營養(yǎng)瓊脂中，等待凝固，再放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)8～10 h，溫度37 ℃，觀察噬菌斑生長情況。

1.2.4 純化噬菌體

使用無菌鑷子扣取培養(yǎng)基內(nèi)的單個噬菌斑，將其放置在裝有1 mL生理鹽水的無菌離心管，水浴30 min，溫度40 ℃，待水浴完畢立即在10 000 r/min條件下予以離心處理5 min，適度稀釋浸出液，將其與宿主菌鋪在雙層平板上，重復扣取單個噬菌斑實施純化操作，直至獲取形態(tài)、大小均一的蝕斑為止，共純化7代。

1.2.5 測定噬菌體效價

使用液體增值法測定效價，扣取單個噬菌斑后制備噬菌體浸出液，采集浸出液500 μL和宿主菌懸液200 μL，與LB肉湯均勻混合后震蕩培養(yǎng)，溫度37 ℃。取增值液在10 000 r/min條件下進行離心處理5 min，適度稀釋后采集200 μL并與宿主菌100 μL鋪雙層平板進行效價檢測。

1.2.6 測定噬菌體裂解譜

使用點樣法進行檢測，采集待測菌懸液100 μL，轉(zhuǎn)移至瓊脂平板上，使用無菌棉簽涂勻，確認菌液吸收完全后取噬菌體增值液2.5 μL，點涂至涂好菌的瓊脂培養(yǎng)基上，確認噬菌體增值液被完全吸收后，將瓊脂培養(yǎng)基放置在溫箱內(nèi)孵育10 h，溫度37 ℃。

1.2.7 觀察噬菌體形態(tài)

取15 μL噬菌體增值液，添加至微孔銅網(wǎng)上進行自然沉降，15 min后借助濾紙吸收多余液體，再滴加2%磷鎢酸10 μL實施染色處理，使用濾紙吸除多余液體，自然干燥后利用電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.8 噬菌體溫度穩(wěn)定性試驗

取噬菌體增值液150 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，放置在 40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和 80 ℃的水浴中，掌握水浴作用20 min、40 min和60 min的效價變化，各溫度梯度重復2次，觀察噬菌體效價在不同溫度梯度中的變化情況。

2 結果

2.1 噬菌體分離結果

經(jīng)本次實驗，成功分離到噬菌體1株，命名為CR5，經(jīng)過7代純化處理后，通過增殖進行效價測定，發(fā)現(xiàn)效價為109PFU/mL。

2.2 噬菌體裂解譜的測定

CR5可成功裂解實驗室儲存的33株沙門菌中的17株，屬于寬裂解譜噬菌體。

2.3 噬菌體電鏡觀察

經(jīng)透射電鏡可清晰觀察到噬菌體CR5由多平面體頭部及細長尾部構成，頭部呈六邊形，直徑約為50 nm，尾部長度約為110 nm，詳見圖1。

2.4 噬菌體溫度穩(wěn)定性實驗

觀察噬菌體效價在不同溫度梯度中的變化情況，結果發(fā)現(xiàn)，噬菌體CR5效價隨溫度變化會發(fā)生相應的變化，具體情況如下：在40 ℃作用1 h后，噬菌體CR5仍可維持原有活性，在50 ℃、60 ℃狀態(tài)中20 min后效價下降，但仍可達到109PFU/mL；在70 ℃狀態(tài)下20 min后，CR5效價快速下降，降至106PFU/mL，在作用1 h后效價降至25 PFU/mL；在80 ℃狀態(tài)中20 min后即完全失活。溫度對噬菌體CR5的影響見圖2。

圖1 噬菌體CR5電鏡下形態(tài)

圖2 噬菌體CR5的熱穩(wěn)定性

3 討論

近年來，多重耐藥沙門菌在全球各地均有報道，因此有效防控沙門菌感染已成為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)關注的重要問題，相關動物實驗結果表明，噬菌體可有效抑制沙門菌感染，與抗生素比較無耐藥性缺陷，可依賴宿主菌完成復制，具有使用劑量小、專一性強、對正常菌群副作用低的優(yōu)勢[5]。噬菌體在自然環(huán)境中分布廣泛，為人類提供豐富抗菌資源庫，目前被分離、利用的噬菌體較少。有學者[6]研究后發(fā)現(xiàn)，噬菌體能夠在宿主菌上吸附，并在宿主菌內(nèi)部生長、增殖，對耐藥宿主菌進行裂解，為沙門菌臨床抗感染治療提供了思路，具有重要的參考意義。本次研究中分離得到的噬菌體CR5效價達到109PFU/mL，且電鏡觀察結果提示，噬菌體CR5呈長尾狀。分析后可知，雙層平板上裂解性噬菌體的蝕斑邊緣清晰、形狀規(guī)則、透亮，能夠清晰觀察噬菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)噬菌體CR5由頭部和尾部兩部分組成，屬于長尾科。而裂解性噬菌體能夠通過裂解宿主菌細胞，加快細菌死亡，在致病菌防控中發(fā)揮著積極的作用。本次分離得到的噬菌體CR5對實驗室保存的33株沙門菌中的17株進行了成功裂解，裂解性較好，但仍有部分沙門菌未得到裂解，提示CR5僅能夠裂解部分種類的沙門菌，具有一定的應用價值。

江艷華[7]對分離到的一株沙門菌噬菌體進行生物學特性分析后發(fā)現(xiàn)，噬菌體具有較好的溫度耐受性，可逐漸降低宿主菌數(shù)目，能夠作為生物抑菌劑防控沙門菌感染。陳義寶等[8]實踐后發(fā)現(xiàn)，使用雙層平板法篩選、純化沙門菌噬菌體，并利用電鏡觀察噬菌體形態(tài)，可了解沙門菌噬菌體的生物學特性，發(fā)現(xiàn)該噬菌體對不同溫度均具有較強的適應能力，裂菌效果良好，可作為抗沙門菌制劑進行開發(fā)。噬菌體CR5不同溫度下的活性試驗證實該種噬菌體具有較好的溫度耐受性，在低溫環(huán)境中可有效降低宿主菌數(shù)量，在較高溫度條件下（40～60 ℃）可于一定時間內(nèi)（1 h）降低宿主菌數(shù)目，之后受殘留宿主菌繁殖速度超過噬菌體裂解速度因素影響，導致抑菌效果受限。因此在宿主菌處于抑制條件時具有良好的裂菌效果，臨床中可通過調(diào)控溫度與聯(lián)合使用其他抗菌制劑的方式，增強抑菌效果。

4 結論

對分離到的噬菌體實施純化、裂解譜檢測、效價檢測、電鏡形態(tài)觀察后發(fā)現(xiàn)，沙門菌噬菌體溫度耐受性較好，屬于一種長尾科、強裂解性噬菌體，能夠有效發(fā)揮抑制沙門菌的效用，具有積極的應用意義。