鄧超

（湖南省核農(nóng)學與航天育種研究所，湖南長沙 410125）

秦艽為龍膽科龍膽屬植物，同屬4個種，能夠作為秦艽藥材使用。秦艽分布在青海省、西藏等地區(qū)，藏醫(yī)使用廣泛。隨著《中國藥典》對中藥制劑中微生物限度要求的不斷提高，中藥制劑的滅菌方式備受重視，尤其是含有生物原粉的中藥制劑。常見的重要滅菌方式包括干熱、濕熱、濾過、輻射等滅菌方法。相關(guān)規(guī)定表示，使用輻射方法滅菌中藥制劑前后，要使用指紋圖譜等對藥品成分種類或者含量變化情況進行充分地展示[1]。因此，本文采用高效液相色譜指紋圖譜分析龍膽與秦艽在鈷60輻照前后的成分變化進行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國Agilen公司），主要包括自動進樣器、真空脫氣機、四元泵、檢測器；德國Binder公司生產(chǎn)S120型超聲清洗機；德國Binder公司生產(chǎn)ED53型干燥箱；山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)全自動臺式蒸汽滅菌器；Thermo公司生產(chǎn)IGS180通用型微生物培養(yǎng)箱；德國Binder公司生產(chǎn)DI115型培養(yǎng)箱；日本三洋公司生產(chǎn)MIR-254型低溫培養(yǎng)箱；WTBbinder公司生產(chǎn)BD240型生物培養(yǎng)箱。

龍膽苦苷（批號：190617-190819，含量96%）、當藥苷（批號：190619-190825，含量93%）、馬錢苷酸（批號：190612-190816，含量97%）、獐芽菜苦苷（批號：190620-190824，含量80%）。

三批龍膽藥材（批號190620、190712、190816）在云南購買，通過鑒定為堅龍膽；三批秦艽藥材（批號190620、190615、190625）通過中一藥業(yè)在甘肅采購，通過鑒定為親近。

色譜純甲醇（液相色譜用）、分析純甲醇（提取用），其余藥品均為分析純[2]，超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻照滅菌

在湖南省核農(nóng)學與航天育種研究所輻照中心使用動態(tài)方式輻照處理龍膽和秦艽樣品。鈷源裝載量為80萬Ci，輻射過程中在樣品包裝盒中采用重鉻酸鉀（銀）-高氯酸劑量計進行防治，確保輻照劑量的精準。第1次輻照劑量為3 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy、25kGy，通過 3 kGy、6 kGy、8 kGy、10kGy輻照的樣品進行第2次劑量為10kGy的輻照，將其作為（3+10） kGy、（6+10） kGy、（8+10） kGy、（10+10） kGy的輻照劑量。

1.2.2 樣品提取

稱取0.5 g過4號篩（65目）的秦艽或龍膽樣品粉末，溶于20.00 mL甲醇（50%）溶液中，超聲提取30 min后搖勻并通過0.45 μm濾膜，得到提取液。超聲前后要稱量溶液質(zhì)量，并通過補充50%甲醇溶液保持恒重。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil G18 5 μm分析柱；流動相為甲醇（A）和0.04%磷酸水溶液（B），按照10∶90、20∶80、30∶70、35∶65的程序進行梯度洗脫；流速設(shè)置為1.00 mL/min；進樣量為4 μL；紫外檢測波長設(shè)置為222 nm，柱溫設(shè)置為30 ℃，采樣時間為70 min[3]。

1.2.4 方法學考察

（1）精密度試驗

精密吸取龍膽苦苷、當藥苷、獐芽菜苦苷、馬錢苷酸標準儲備液20 μL，連續(xù)進樣6次。

（2）穩(wěn)定性試驗

將“1.2.2”中獲得的提取液分別在放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h后進樣20 μL，測定峰面積，并計算RSD值。

（3）重復性

對各提取液進行3次進樣，制備供試品溶液，記錄指紋圖譜，測定峰面積，計算平均值[4]。

1.2.5 成分變化百分率計算

成分變化百分率采用公式（1）計算。

公式中的Ai指的是第i個劑量中某峰面積，A0指的是未輻照樣品中某峰的峰面積，Wi指的是i個劑量供試品稱樣量，W0指的是未輻照樣品稱樣量。將成分變化百分率作為縱坐標，輻照劑量作橫坐標，對比指紋圖譜各峰變化的情況。

1.3 方法學試驗結(jié)果

通過上述穩(wěn)定性試驗、精密度試驗和重復性試驗分析，表明該試驗方法精密度、重復性良好，供試品溶液在48 h之內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)果分析

3.1 成分變化

圖1和圖2為龍膽、秦艽3批樣品在輻照劑量中的成分和未輻照樣品對比情況?？梢钥闯?，龍膽輻照之后峰1含量提高，25kGy輻照之后3批樣品峰1含量分別為113%、127%和127%。峰7通過輻照之后含量在不斷降低，10kGy輻照之后3批樣品龍膽苦苷含量為未輻照樣品的65%、59%、56%，25kGy輻照之后龍膽苦苷含量是未輻照樣品的39%、45%、38%，其他峰沒有明顯改變。

秦艽輻照之后峰8（龍膽苦苷）含量降低，10 kGy輻照之后3批樣品龍膽苦苷含量為未輻照樣品的74%、73%和66%；25kGy輻照后龍膽苦苷含量為未輻照樣品的65%、58%、49%。峰7含量也不斷降低，通過25kGy輻照后3批樣品是未輻照樣品的83%、77%、69%。峰1含量不斷增加，變化并不明顯，其他峰沒有改變[5]。

圖1 3批龍膽樣品在不同輻照劑量下的成分和未輻照樣品對比情況

圖2 3批秦艽樣品在不同輻照劑量下的成分和未輻照樣品對比情況

3.2 相似度分析

使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》分析輻照前后色譜圖，各批樣品將同批未輻照樣品作為對照，對其他輻照劑量中色譜圖相似度進行計算。結(jié)果表明，輻照之后的秦艽和龍膽樣品與同批次輻照之前樣品色譜圖的相似度大于0.95。圖3為秦艽樣品的聚類圖。因為部分的峰面積增加或者降低，沒有峰個數(shù)缺失或者增加，因此輻照之后樣品指紋圖譜和輻照前的樣品具有較高的相似度，在輻照劑量不斷增加中，相似度也在不斷的降低。

3.3 主要已知成分定量結(jié)果

使用外標法對已知4個成分定量。表1為沒有輻照和經(jīng)25kGy劑量輻照的3批龍膽與秦艽樣品中4個成分的含量?？梢钥闯?，輻照之后龍膽苦苷含量明顯降低，其他3個成分含量變化不大或有少量減少，規(guī)律和3.1相同，也與《中國藥典》中的結(jié)果相同[6]。

圖3 秦艽樣品的聚類圖

表1 沒有輻照和經(jīng)25kGy劑量輻照的龍膽和秦艽中4個成分含量的對比

4 結(jié)論

創(chuàng)建指紋圖譜方法能夠滿足秦艽和龍膽輻照前后成分含量改變的研究需求。研究結(jié)果表明，秦艽和龍膽中龍膽苦苷的含量隨著輻照劑量的增加而降低，與其他研究人員研究結(jié)果一致；龍膽中未知色譜峰（峰1）在輻照之后含量不斷增加，秦艽中獐芽菜苦苷含量不斷降低，未在其他研究中發(fā)現(xiàn)相似變化。