高鐸,孔繁雪,韓鐫竹,武鳳嬌,郭玉翠,李欣南*
(1.遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心,遼寧沈陽110000;2.沈陽藥科大學(xué),遼寧沈陽117004)
抗生素是目前治療細(xì)菌感染的主要藥物,其出現(xiàn)和使用為人類健康做出了不可磨滅的貢獻(xiàn),對動物疾病的預(yù)防與控制作用同樣功不可沒。但不規(guī)范用藥則會引發(fā)畜禽的群體性危害,造成獸藥殘留超標(biāo)、產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題。為了滿足人類對動物性食品不斷增長的需求,人們在畜禽養(yǎng)殖過程中常常大量使用抗生素類藥物來預(yù)防動物性疾病并促進(jìn)生長。抗生素的殘留使得一些動物體內(nèi)的細(xì)菌常暴露在抗生素環(huán)境中,體內(nèi)的耐藥菌株將會得到選擇性增殖,使得抗生素的治療效果下降[1-2]。
金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus),是革蘭氏陽性菌的代表,可引起許多嚴(yán)重感染,是臨床上重要的致病菌,特別是超級細(xì)菌-耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)及其耐藥性的快速增長,使其成為全球內(nèi)感染的首要病原菌。金黃色葡萄球菌常引起兩類疾?。海?)化膿性疾病,主要引起動物的乳房炎、關(guān)節(jié)炎等,可通過動物傳遞給人類;(2)毒素性疾病,會引起人和動物的中毒性嘔吐等,嚴(yán)重威脅人類的食品安全和公共衛(wèi)生[3-6]。
微生物比濁法能直觀地反應(yīng)抗生素總的抗菌能力[7-8],因此利用該原理,本文選擇了慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星3種不同類型的藥物,實(shí)時測定并繪制時間-吸光度抑菌生長曲線,以此分析3種藥物在不同濃度下、不同時間節(jié)點(diǎn)上與細(xì)菌相互作用的關(guān)系,旨在為藥效學(xué)的研究、解決細(xì)菌耐藥性及指導(dǎo)臨床合理使用抗生素提供數(shù)據(jù)和試驗(yàn)參考。
質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213,購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司;實(shí)驗(yàn)菌株DX1、XNC22于養(yǎng)殖場中分離獲得。
CLASS Ⅱ生物安全柜,購自美國NUAIRE公司;全自動高壓滅菌器,購自日本三洋電器集團(tuán);恒溫培養(yǎng)箱,購自德國BINDER公司;VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng),購自BIOMERIEUX公司;WBS-100微生物比濁法測定儀,購自北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司。
抗生素檢定培養(yǎng)基3號,購自北京中海生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂,購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;革蘭氏陽性菌鑒定卡(GP鑒定卡),購自BIOMERIEUX公司;標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或中國食品藥品檢定研究院。
1.4.1 菌懸液的制備
根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI,Clinical and Laboratory Standards Institute )對菌懸液濃度的要求[9],來稀釋菌懸液。將保存的菌種接種于配制好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出待用,在生物安全柜中,用棉簽取單菌落于裝有0.85%滅菌生理鹽水的安瓿瓶中,用麥?zhǔn)媳葷醿x將試驗(yàn)菌液濃度調(diào)節(jié)為0.5麥?zhǔn)希?.5麥?zhǔn)暇鷳乙旱臐舛燃s為1.5×108cfu/mL),后進(jìn)一步稀釋至5×105cfu/mL,備用。
1.4.2 儲備藥液的制備
將慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品分別溶解并稀釋成2048μg/mL的抗生素貯存液。配制的藥液以質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC?29213進(jìn)行質(zhì)控,其最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)值在CLSI允許的范圍內(nèi)。
1.4.3 微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)
采用CLSI指定的微量稀釋法,進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)[9]。取稀釋至5×105cfu/mL濃度的菌液0.1mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中,混勻使試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的50%,并設(shè)置陽性對照和陰性對照。將加有菌液和抗菌藥物的板置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~20 h。觀察記錄結(jié)果,以無菌生長的最低抗菌藥物溶液的濃度為MIC值。判定標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI標(biāo)準(zhǔn),具體見表1,按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性為敏感(S),中度敏感(I)或耐藥(R)。
1.4.4 濁度法-體外藥物敏感性試驗(yàn)
根據(jù)質(zhì)控菌和試驗(yàn)菌的微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)獲得的MIC值,分別用水稀釋成4個不同的藥物濃度,備用。向比濁管中按拉丁方排列加入配制好的系列濃度藥物1.00mL,再加入9.00mL適宜濃度的菌懸液,使菌液終濃度為5×105cfu/mL,藥物終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。
表1 金黃色葡萄球菌藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍
表2 不同藥物濃度拉丁方排列方式
將添加有不同濃度藥物、菌液混懸液的比濁管放入到WBS-100微生物比濁法測定儀中,培養(yǎng)溫度為37℃,監(jiān)測間隔時間為30min,監(jiān)測時長為16h,測定實(shí)時吸光度。試驗(yàn)結(jié)束后通過不同時間節(jié)點(diǎn)的吸光度值使用Excel繪制其時間-吸光度抑菌生長曲線。
如表3所示,微量稀釋法-藥物敏感性試驗(yàn)測得的MIC結(jié)果與濁度法測得的結(jié)果無顯著差異,但濁度法試驗(yàn)為實(shí)時吸光值信號采集,獲得的結(jié)果可能更接近實(shí)際的MIC值,而通過時間-吸光度曲線進(jìn)行MIC終點(diǎn)判讀則更直觀和準(zhǔn)確。
如圖1所示,3種藥物的分離菌株生長曲線都是前期呈不斷增長的趨勢,到后期明顯逐漸下降,而質(zhì)控菌株呈現(xiàn)增長的趨勢,下降趨勢不明顯;不論是分離菌株還是質(zhì)控菌株,呈現(xiàn)的生長曲線的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC曲線下面積不同;1/8MIC先于1/4MIC進(jìn)入對數(shù)生長期,1/4MIC先于1/2MIC進(jìn)入對數(shù)生長期;紅霉素、慶大霉素的分離菌1/2MIC先于質(zhì)控菌1/2MIC進(jìn)入對數(shù)生長期;氧氟沙星為快速殺菌劑,其1/2MIC進(jìn)入對數(shù)生長期較紅霉素和慶大霉素早。紅霉素為時間依賴型抗生素,其抑菌時間比慶大霉素和氧氟沙星都要長。。
通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時間-抑菌生長曲線分析,可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度(1/2 MIC)的壓力下,其生長趨勢呈現(xiàn)了不同于理論設(shè)想的情況,可能并非是細(xì)菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半。
表3 3種抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MIC
圖1 金黃色葡萄球菌在3種抗菌藥物作用下的時間-吸光度曲線
圖2 質(zhì)控菌株ATCC29213在3種抗菌藥物作用下的時間-吸光度曲線
已有研究表明,亞抑菌濃度下細(xì)菌耐藥基因的水平傳播可能性增加,突變株數(shù)量大于野生株數(shù)量,還會形成生物膜,這些都可導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生,而亞抑菌濃度的藥物壓力下,耐藥菌株還會被選擇性富集,因此亞抑菌濃度下細(xì)菌與藥物的作用關(guān)系很有研究價值[10-12]。不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時間有顯著差異,高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期較低濃度藥物有一定的延遲,目前還不明確金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度下是否會蓄積不同耐藥機(jī)制的耐藥菌株,即藥物壓力下快速進(jìn)入對數(shù)期的細(xì)菌可能為獲得耐藥性的細(xì)菌。但也有研究證實(shí),發(fā)生突變的高水平耐藥菌的適應(yīng)性與其親本株相比大多數(shù)出現(xiàn)適應(yīng)性下降[13];耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現(xiàn)先增長后減小的趨勢;濁度法下的時間-抑菌生長曲線可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時間進(jìn)行可視化判定,慶大霉素、氧氟沙星為濃度依賴型,可見不同藥物濃度對細(xì)菌生長繁殖影響較大,而紅霉素為時間依賴型,隨著時間的延長,不同藥物濃度的抑菌時間均比慶大霉素、氧氟沙星長,提示時間依賴型藥物的抑菌時間均比濃度依賴型藥物長。
濁度法較微量稀釋法比較具有5點(diǎn)優(yōu)勢:(1)濁度法可以進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控,測定其實(shí)時吸光值,反映金黃色葡萄球菌生長的動態(tài)趨勢,微量稀釋法只能在第2 d觀察結(jié)果;(2)濁度法可以使用現(xiàn)有的濁度分析儀,實(shí)現(xiàn)自動化數(shù)據(jù)采集;(3)濁度法結(jié)合振搖培養(yǎng),保證了藥物與細(xì)菌的充分作用;(4)濁度法終點(diǎn)判讀時更直觀;(5)濁度法可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時間進(jìn)行可視化判定。
通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時間-抑菌生長曲線分析,金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度(1/2 MIC)的壓力下,可能并非是細(xì)菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半;不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時間有顯著差異,高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期較低濃度藥物有一定的延遲;耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現(xiàn)先增長后減小的趨勢;隨著時間的延長,不同藥物濃度的紅霉素抑菌時間均比慶大霉素、氧氟沙星長。