袁橙，郭長(zhǎng)明，張步彩，左偉勇，唐晨晨，藺輝星

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

菌蛻是利用裂解基因制成的革蘭陰性細(xì)菌的菌殼，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的體液、細(xì)胞和黏膜免疫，被認(rèn)為是一類新型的候選疫苗[1–2]。研究[3–6]發(fā)現(xiàn)，菌蛻在不同種的血清型之間能誘導(dǎo)交叉免疫保護(hù)作用。同時(shí)，菌蛻具有免疫佐劑性質(zhì)及遞送系統(tǒng)功能，可以將其他抗原錨定于菌蛻表面，制備成重組疫苗，或?qū)⑺幬镅b載于菌蛻，用于疾病的靶向治療；菌蛻疫苗和載體還具備制備工藝簡(jiǎn)單、保存與運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)；因此，菌蛻有較為廣闊的應(yīng)用前景。

禽致病性大腸埃希菌(avian pathogenicEscherichia coli，APEC)能夠通過呼吸道感染宿主(雞、火雞等各種禽類)，繼而在宿主體內(nèi)定殖，引發(fā)宿主一系列的臨床癥狀，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[7–9]。APEC菌蛻與活疫苗相比，具有相同功能的膜抗原表面結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答；與傳統(tǒng)變性滅活菌苗相比，菌蛻完好地保留了細(xì)菌菌體的各種抗原結(jié)構(gòu)，又沒有任何免疫原性的改變。有研究[10–11]顯示，用 APEC強(qiáng)毒株或基因缺失株制備的菌蛻在動(dòng)物免疫試驗(yàn)中表現(xiàn)出比傳統(tǒng)甲醛滅活疫苗更高的保護(hù)效率，是一種較有潛力的候選疫苗。

目前，對(duì)牛、豬、雞和魚用革蘭陰性菌菌蛻疫苗研制的報(bào)道較多[1–6,12]，但對(duì)水禽致病性大腸埃希菌菌蛻疫苗制備的報(bào)道較少。本研究中，從具有禽大腸埃希菌病典型臨床癥狀的鴨內(nèi)臟器官中分離 1株鴨致病性大腸埃希菌，分析其血清型、系統(tǒng)進(jìn)化分群及相關(guān)毒力基因，并將表達(dá)噬菌體裂解蛋白的溶菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入該菌株，制備鴨致病性大腸埃希菌菌蛻，檢測(cè)菌蛻的免疫原性，旨在為研制禽致病性大腸埃希菌菌蛻疫苗和可用于禽類細(xì)菌病、病毒病和寄生蟲病的新型疫苗載體或佐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試鴨和菌株及主要試劑

試驗(yàn)動(dòng)物櫻桃谷鴨購自江蘇省某種鴨公司。溫控表達(dá)質(zhì)粒 pBV221、DH5α菌株由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物流行病學(xué)研究中心保存。禽致病性大腸埃希菌菌株分離自江蘇省某水禽場(chǎng)的病鴨。

藥敏紙片和微量生化發(fā)酵管購自浙江省杭州濱和微生物試劑有限公司。大腸埃希菌單因子血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。麥康凱瓊脂干粉、SOC培養(yǎng)基、瓊脂粉、氯化鈉、TBE電泳緩沖液、甘油等購自索萊寶生物科技有限公司。PCR試劑盒、Ultra GelRed Nucleic Acid Stain、DL2000 Plus DNA Marker等購自南京諾唯贊生物科技有限公司。Anti–Duck IgG(H+L)–Peroxidase 抗體購自 KPL 公司?？扇苄蛦谓M分TMB底物溶液購自天根生化科技(北京)有限公司。限制性內(nèi)切酶和連接酶為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品。細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物、胰蛋白胨和氨芐青霉素為 Sigma-Aldrich產(chǎn)品。

按常規(guī)方法[13]制備LB液體和固體培養(yǎng)基?？剐赃x擇培養(yǎng)基中氨芐青霉素的質(zhì)量濃度為 100 mg/L。

1.2 菌株的分離鑒定

無菌采集病死鴨的心血、肝臟等病料，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，將瓊脂平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日取出進(jìn)行菌落形態(tài)觀察。挑取麥康凱平板上的典型菌落進(jìn)行革蘭染色和鏡檢，并將鏡檢結(jié)果為革蘭陰性的細(xì)菌轉(zhuǎn)接于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、吲哚、MR、枸櫞酸鹽、VP、硫化氫等細(xì)菌生化微量鑒定管及三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行生化鑒定。參考已報(bào)道的針對(duì)大腸埃希菌16s RNA基因保守區(qū)的引物，對(duì)所分離的臨床菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)[14–15]，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各20 pmol，模板DNA 2 μL，加雙蒸水至總體積 25 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 4 min；95 ℃變性30 s，不同基因的相應(yīng)退火溫度下(表1)反應(yīng)30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 大腸埃希菌檢測(cè)所用引物Table 1 Primers for detection of Escherichia coli

1.3 O血清型鑒定

將經(jīng)過生化鑒定的大腸埃希菌接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，次日，將細(xì)菌培養(yǎng)物于121 ℃、103.4 kPa下處理2 h后，離心棄上清，用400 μL 0.5%的苯酚溶液重懸菌體，制成濃稠懸液，作為大腸埃希菌菌體抗原，備用。取7 μL菌體抗原和2 μL大腸埃希菌O抗原血清置于玻板上混勻，出現(xiàn)凝集即可初步定型，再通過試管凝集試驗(yàn)進(jìn)一步確定血清型[16]。

1.4 分群分析和毒力基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[17–21]中序列，合成chuA、yiaA和DNA 片段TspE4.C2的擴(kuò)增引物(表1)。依據(jù)CLERMONT等[17]建立的將大腸埃希菌分為A、B1、B2和D群的分群方法進(jìn)行分群分析。參照已發(fā)表的毒力基因引物序列[17–21]合成檢測(cè)引物(表1)，制備模板DNA，分裝后置于–20 ℃保存。按1.2中的方法進(jìn)行PCR檢測(cè)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.5 分離菌株的耐藥性檢測(cè)

參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)方法手冊(cè)(2007年版)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)菌株的耐藥性，檢測(cè)的抗生素包括氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素。依據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇合適抗性的原核表達(dá)載體，構(gòu)建溶菌質(zhì)粒。

1.6 溶菌質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的φX174噬菌體裂解蛋白E的基因序列合成E基因，并連接至pUC57載體，命名為pUC57–E。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pUC57–E和表達(dá)載體pBV221，利用T4DNA連接酶將E基因片段連接至載體pBV221，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性平板上篩選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，從菌液中提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，將構(gòu)建成功的溶菌質(zhì)粒命名為pBV221–E。

1.7 菌蛻的制備

參照文獻(xiàn)[8]，制備鴨致病性大腸埃希菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將pBV221–E和pBV221分別轉(zhuǎn)化至分離菌株。用氨芐抗性平板篩選陽性克隆，通過鑒定的陽性克隆分別命名為 pBV221–E/D 和pBV221/D，并進(jìn)行溶菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。將pBV221–E/D和pBV221/D菌液于28 ℃振蕩培養(yǎng)至A600nm約為0.5時(shí)，取pBV221–E/D菌液樣品作為誘導(dǎo)前對(duì)照，然后將菌液等分為2瓶，一瓶置于42℃誘導(dǎo)表達(dá)，另一瓶還置于28 ℃，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔30 min取樣測(cè)定A600nm值，至pBV221–E/D菌液的A600nm值不繼續(xù)下降，此時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌蛻溶液，并取出少量pBV221–E/D菌液作為誘導(dǎo)后樣品。將誘導(dǎo)前的 pBV221–E/D菌液用 0.9%NaCl溶液進(jìn)行 10–4、10–5、10–6稀釋，升溫誘導(dǎo)后的菌液用 0.9%NaCl溶液進(jìn)行 10–1、10–2、10–3稀釋，每個(gè)稀釋度涂3塊無抗LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，選取合適稀釋度的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取cfu平均值計(jì)算裂解率[22]。

1.8 透射電鏡檢測(cè)

用負(fù)染色方法[22]對(duì)42 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2.5 h的大腸埃希菌pBV221–E/D和pBV221/D菌液樣品進(jìn)行染色；用Philips透射電子顯微鏡(Tecnai 12)觀察菌體結(jié)構(gòu)。

1.9 菌蛻免疫原性檢測(cè)

按上述制備方法，制備大量大腸埃希菌菌蛻，并測(cè)算裂解率。菌蛻溶液中加入β–丙內(nèi)酯至終濃度為0.025%，再將菌液置于42 ℃作用1 h，離心收集菌體，菌體沉淀用滅菌 PBS(磷酸鹽緩沖溶液)清洗3遍后重懸，加入β–丙內(nèi)酯至終濃度為0.05%，再置于42 ℃作用2 h，制成菌蛻疫苗，并取少量懸濁液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和菌體計(jì)數(shù)。選取體質(zhì)量接近的 7日齡櫻桃谷鴨40只，隨機(jī)分成2組，每組20只。分別在頸部皮下接種菌蛻疫苗(1×109cfu/只)和等體積(200 μL)無菌 PBS；2周后以相同劑量再免疫 1次。分別于首免和二免后2周采集血液，分離血清。用鴨致病性大腸埃希菌分離株全菌抗原(1×109cfu/mL)包被酶標(biāo)板，將血清樣品稀釋500倍后，用間接ELISA法[22]檢測(cè)血清抗體(IgG)效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的分離鑒定結(jié)果

根據(jù)病鴨臨床癥狀、細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和16s RNA擴(kuò)增測(cè)序的結(jié)果，確定分離菌株為大腸埃希菌。通過玻板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)鑒定，該菌株血清型為O24。

2.2 供試菌株的分群分析和毒力基因檢測(cè)結(jié)果

從圖1可知，chuA和yiaA的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，TspE4.C2為陽性，據(jù)此確定該菌株為B1型。從圖2可知，fimC、csgA和iroN這3個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果為陽性，kpsM、papC、felA、tsh、irp–2、iutA、cvaC和iss這8個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果為陰性，說明該菌株具有fimC、csgA和iroN這3個(gè)毒力基因。

圖1 鴨致病性大腸埃希菌的chuA、yjaA和TSPE4.C2基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The amplification products of chuA, yjaA and TSPE4.C2 of pathogenic Escherichia coli from duck

圖2 鴨致病性大腸埃希菌的毒力基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 The amplification products of virulence gene of pathogenic Escherichia coli from duck

2.3 供試菌株的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

分離株對(duì)四環(huán)素不敏感，對(duì)氨芐青霉素、慶大霉素及卡那霉素敏感；因此，選擇對(duì)氨芐青霉素有抗性的pBV221載體進(jìn)行溶菌質(zhì)粒的構(gòu)建。

2.4 供試菌株溶菌質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

用EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pBV221–E可獲得目的基因E和線性化pBV221，條帶大小與預(yù)測(cè)一致(圖3)。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示E基因片段序列正確。

圖3 pBV221–E質(zhì)粒的EcoR I和Sal I雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 The result of identification of recombinant plasmid pBV221-E digested by EcoR I and Sal I

2.5 供試菌蛻制備效率檢測(cè)結(jié)果

如圖4所示，在誘導(dǎo)30 min后pBV221–E/D菌液的A600nm開始下降，誘導(dǎo)120 min后A600nm值趨于穩(wěn)定，約為 0.3；而誘導(dǎo)培養(yǎng)后的 pBV221/D和28 c培養(yǎng)的pBV221–E/D對(duì)照菌液的A600nm值一直保持上升趨勢(shì)。pBV221–E/D裂解率為99.96%。

圖4 鴨致病性大腸埃希菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of pathogenic Escherichia coli from duck after inducing

2.6 供試菌的透射電鏡檢測(cè)結(jié)果

誘導(dǎo)培養(yǎng)2.5 h后的pBV221/D對(duì)照菌呈現(xiàn)完整的細(xì)菌結(jié)構(gòu)(圖5–a)，電子密度較高且分布均勻；而誘導(dǎo)后的pBV221–E/D菌體電子密度降低且分布不均勻(圖5–b)，菌膜上有孔道形成，孔道寬度約為150 nm(圖5–c箭頭所指)，細(xì)胞質(zhì)通過孔道外泄，細(xì)胞膜有較為明顯的皺縮變形；誘導(dǎo)前后菌體的鞭毛均清晰可見。

圖5 鴨致病性大腸埃希菌的透射電鏡檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The detection result of pathogenic Escherichia coli from duck by transmission electron micrographs

2.7 供試菌蛻的免疫原性

大量制備的大腸埃希菌菌蛻裂解率達(dá)99.99%；經(jīng)β–丙內(nèi)酯2次滅活處理后的菌蛻溶液涂布LB固體平板后未見菌落長(zhǎng)出，說明菌蛻溶液中無活菌存在。如圖6所示，菌蛻免疫組鴨的血清IgG水平在二免后上升，且顯著高于PBS對(duì)照組的(P＜0.05)。以 PBS對(duì)照組為陰性值(N)，菌蛻免疫組為陽性值(P)，求得一免后2周和二免后2周的P/N值分別為1.903(0.371/0.195)和 4.918(0.954/0.194)，二免后 2周的P/N值大于2.1，判定為陽性血清。

圖6 間接ELISA檢測(cè)櫻桃谷鴨的血清IgG水平Fig.6 The serum IgG levels of Cherry Valley duck detected by indirect ELISA

3 結(jié)論與討論

胡林等[23]對(duì)華東部分地區(qū) 66株禽致病性大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化分群的分析顯示，A、B1、B2、D群菌株數(shù)分別占 33.4%、31.8%、13.6%、21.2%。張旭等[16]對(duì) 2015—2016年分離自江蘇和山東部分地區(qū)的173株禽大腸埃希菌的血清型、致病性等流行病學(xué)特征進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示優(yōu)勢(shì)血清型有O78(21%)、O24(12%)和 O1(10%)。牛春玲[24]在華東地區(qū)分離的480株鴨源APEC菌株中，A、B2群分別占 56.25%、19.17%。董向磊[25]分離得到 240株APEC菌株，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B2和D型占49.58%，認(rèn)為在iutA、iss、tsh、iroN、irp–2、cvaC這6個(gè)基因中，如分離株的毒力基因數(shù)不小于 2個(gè)，即有89.74%的概率認(rèn)定該分離株具有致病性。

本研究中，用于制備菌蛻的APEC菌株分離于江蘇省某水禽場(chǎng)的病鴨；通過玻板凝集和試管凝集試驗(yàn)確定該菌株的血清型為 O24，是江蘇地區(qū)APEC的優(yōu)勢(shì)血清型；對(duì)菌株進(jìn)行分群分析和毒力基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該菌株屬于B1群，并具有fimC、csgA和iroN這3個(gè)毒力基因，初步推測(cè)其具有致病性；在誘導(dǎo)30 min后pBV221–E/D菌液A600nm開始下降，誘導(dǎo)120 min后A600nm數(shù)值趨于穩(wěn)定，說明重組菌株在誘導(dǎo)后30 min內(nèi)E蛋白即開始表達(dá)，誘導(dǎo)120 min后細(xì)菌裂解完全。ZHU等[12]的研究顯示，如菌液吸光度為0.6時(shí)開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)30 min后菌液吸光度下降至最低；如菌液吸光度為1.2時(shí)開始誘導(dǎo)，則需誘導(dǎo)120 min后菌液吸光度下降至最低。這些誘導(dǎo)時(shí)間上的差別可能是由于菌液起始濃度不同、菌株自身差異或E蛋白表達(dá)效率不同等原因引起的。本研究中，細(xì)菌裂解效率達(dá)99.9%以上，與文獻(xiàn)[10–11]報(bào)道的結(jié)果一致；電鏡觀察結(jié)果顯示，菌蛻上孔道的寬度約為150 nm，細(xì)菌內(nèi)容物通過孔道溢出，菌體皺縮變形，電子密度降低，這與ZHU等[12]、TUNTUFYE等[26]和LANGEMANN等[27]的報(bào)道一致；細(xì)菌的鞭毛結(jié)構(gòu)清晰完整，說明在菌蛻制備過程中菌體結(jié)構(gòu)得到完整保存；在菌蛻疫苗制備中選擇β–丙內(nèi)酯作為滅活劑，與傳統(tǒng)的甲醛滅活法[10–11,22]相比有可水解、無殘留等優(yōu)勢(shì)；免疫原性檢測(cè)結(jié)果顯示，2次免疫后菌蛻可使雛鴨血清IgG水平顯著提高，說明該菌蛻可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，與何亮[22]的研究結(jié)果一致。但對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)中，一免后2周的血清IgG水平低于何亮的研究結(jié)果，可能是菌株來源不同造成了免疫原性的差異。

綜上可知，通過將pBV221–E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至APEC分離株，調(diào)節(jié)細(xì)菌培養(yǎng)溫度誘導(dǎo)E蛋白表達(dá)，成功獲得鴨源APEC菌蛻，且該菌蛻可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫。