陳聰，劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

低芥酸、零芥酸是油菜育種的長期目標(biāo)，也是評價油菜品質(zhì)的重要指標(biāo)。菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷含量也是“雙低”油菜育種的重要目標(biāo)[1]。菜籽餅粕因富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的飼用價值，因而受到許多研究人員的重視。但硫代葡萄糖苷經(jīng)動物食用后，在胃腸條件下會水解生成硫氰酸鹽等有毒物質(zhì)[2]，從而引起食欲不振等健康問題，影響動物的正常發(fā)育。

王繼變等[3]通過構(gòu)建甘藍型油菜 DH群體(doubled haploid，雙單倍群體)，QTL(quantitative trait locus，數(shù)量性狀基因座)分析發(fā)現(xiàn)，控制芥酸含量的QTL位點位于A2、A7、A9和C1上，控制油酸合成的QTL位點位于A9和C7上。QIU等[4]與ECKE等[5]通過構(gòu)建甘藍型油菜DH群體與QTL分析，均發(fā)現(xiàn)在A8與C3的相同位置上存在控制芥酸合成的 QTL。薦紅舉等[6]通過 QTL定位甘藍型油菜種子硫代葡萄糖苷含量QTL，結(jié)合高密度SNP遺傳圖譜，檢測到5個QTL，分布在A3、A9、C2染色體上。王金芳[7]通過構(gòu)建DH作圖群體，定位到2個控制油酸合成的QTL，分布在A5與A9染色體上，分別能解釋75.9%、3%～5%的表型變異。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome whole association study，GWAS)，也稱為連鎖不平衡作圖(linkage disequilibrium mapping)，是近10年來鑒定控制農(nóng)作物復(fù)雜數(shù)量性狀基因座的重要方法，已廣泛應(yīng)用于谷子[8]、小麥[9]、玉米[10]、油菜[11]等農(nóng)作物。目前，在油菜領(lǐng)域內(nèi)，GWAS已成功應(yīng)用于含油量[12]、開花時間[13]、株高[14]、角果長度[15]、種子萌發(fā)與活力[16]等重要性狀的研究。

本研究以 104份甘藍型自交系群體為研究材料，對芥酸、油酸、硫代葡萄糖苷含量等品質(zhì)性狀進行分析考察，采用 ddRADseq測序技術(shù)，運用GWAS方法將性狀與 SNP標(biāo)記關(guān)聯(lián)，以尋找與性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，為高品質(zhì)“雙低”甘藍型油菜品種的培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以甘藍型油菜高代自交系群體為關(guān)聯(lián)分析群體，總共104份材料，其中黃籽材料44份，黑籽材料 60份。簡化基因組測序中用到的參考基因組為法國冬油菜Dammar v4.1。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗設(shè)計與性狀考察

2017年9月下旬，將104份甘藍型油菜自交系播種于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地。每份材料種植1個小區(qū)，每個小區(qū)5行，行距40 cm。10月中下旬間苗，每行定苗10～12株，株距20 ～ 30 cm，其他管理同大田常規(guī)管理。

油菜成熟后每個小區(qū)收獲3份單株自交種子，采用近紅外光譜法測定芥酸、油酸、硫代葡萄糖苷含量，每份材料用近紅外儀Foss NIR systems 5000掃描3次，取其平均值。利用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與相關(guān)性分析。

1.2.2 簡化基因組測序分型與群體結(jié)構(gòu)分析

由武漢基諾賽克科技有限公司采用基于新一代測序平臺 Illumina HiSeq的 ddRADseq (double digested restriction–site associated DNA Sequencing )技術(shù)進行簡化基因組測序。基因組DNA經(jīng)檢測合格后，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和MseⅠ進行雙酶切，經(jīng)PCR擴增、純化，篩選插入長度在300 ～ 400 bp的片段進行測序[17]，原始測序讀長為Paired–end 150 bp。對于下機的原始數(shù)據(jù)(raw reads)，用 Cutadapt與Trimmomatic進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，然后將得到的clean data比對到參考基因組(Darmor v4.1)[18]上，進行變異檢測(包含 SNP與 InDel)，得到原始的包含變異信息的vcf格式文件。利用 Plink1.9[19]對標(biāo)記進行篩選，過濾掉缺失率(missing rate)大于20%的標(biāo)記，同時剔除次要等位基因頻率(MAF)小于5%的標(biāo)記。

采用 Admixture1.3.0[20]計算甘藍型油菜群體結(jié)構(gòu)Q，通過CV error值(cross–validation error rate, 交叉驗證錯誤率)判斷最佳分群數(shù)。使用 Plink1.9(–indep–pairwise 50 5 0.5)過濾掉鄰近連鎖較強的SNP，用于群體結(jié)構(gòu)分析。獲得的Q矩陣采用Excel作CV error值，獲得趨勢圖，用R語言作群體結(jié)構(gòu)圖。利用Tassel 5.2.40對自交系群體104份油菜自交系進行親緣關(guān)系評估，得到親緣關(guān)系矩陣，依據(jù)YU等[21]的定義，當(dāng)計算結(jié)果出現(xiàn)親緣關(guān)系值為負(fù)數(shù)時，則定義為0。

1.2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

運用Tassel 5.2.40進行關(guān)聯(lián)分析，采用混合線性模型，對群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系進行校正。關(guān)聯(lián)分析完成后，用R語言CMplot包繪制Q–Q圖與Manhattan圖，以P=0.01/N(N為關(guān)聯(lián)分析時用到的標(biāo)記的總數(shù))為閾值，篩選與性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)性狀的統(tǒng)計分析

運用近紅外儀測定了104份材料的芥酸、油酸、硫代葡萄糖苷含量，相關(guān)性分析結(jié)果(表1)表明：芥酸含量與硫代葡萄糖苷含量之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.349(P=0.008 4)；油酸與芥酸、硫代葡萄糖苷含量之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為–0.894 (P=0.006 3)、–0.428(P=0.005 2)。在 104份材料中，芥酸含量變化范圍為0.00% ～ 46.99%，平均值為6.04%，變異系數(shù)高達214.94%；油酸含量平均值為63.32%，變化范圍為8.27% ～ 93.16%，變異系數(shù)為 30.89%；硫代葡萄糖苷含量平均值為27.45 μmol/g，變化范圍為 3.56 ～ 60.16 μmol/g，變異系數(shù)為36.46%，說明供試材料變異較豐富。

表1 供試材料3個品質(zhì)性狀的平均值及變異系數(shù)Table 1 The mean value and coefficient of variation of three quality traits

2.2 基因分型與群體結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 簡化基因組測序結(jié)果

基于ddRADseq技術(shù)，對104份材料進行了簡化基因組測序，大部分測序位點堿基質(zhì)量分值都在Q30以上，將獲得的clean reads序列與參考基因組(法國冬油菜 Dammar v4.1)進行比對，每份材料的平均reads數(shù)為1 917 862，平均覆蓋度為2.48%，平均覆蓋深度為11.14 倍。簡化基因組測序獲得了2 106 617個 SNP標(biāo)記，經(jīng)過濾獲得28 127個高質(zhì)量的SNP標(biāo)記。

2.2.2 群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系

運用Admixture1.3.0計算群體的遺傳結(jié)構(gòu)，根據(jù)連鎖不平衡強度，篩選4 778個均勻分布在染色體上的SNP標(biāo)記，對K值從1到10進行模擬運算，得到CV error值(圖1)。當(dāng)K=4時，CV error值最小。將104份甘藍型自交系群體劃分為4個亞群，分群情況見圖2。P1亞群包含15個甘藍型油菜品系；P2亞群包含28個甘藍型油菜品系；P3亞群包含38個甘藍型油菜品系；P4亞群包含23個甘藍型油菜品系。

圖1 不同K值的CV errorFig.1 CV error with different K value

圖2 104份甘藍型油菜自交系群體結(jié)構(gòu)Fig.2 Population structure of 104 Brassica napus

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用混合線性模型(mixed linear model, MLM)，運用Tassel 5.2.40對104份自交系群體材料種子中的芥酸、油酸和硫代葡萄糖苷含量進行 GWAS 分析(圖3)，檢測到與芥酸、油酸、硫代葡萄糖苷含量顯著關(guān)聯(lián)的 SNP位點數(shù)分別為 42、61、27。與芥酸含量顯著關(guān)聯(lián)的 SNP位點在 A08、C02、C03、C05與C08染色體上均有分布，其中C03染色體上分布的SNP位點最多，為19個，單個SNP對表型的解釋率為 4.85%～24.45%；與油酸含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點分布在A05、A08、C03、C05、C07與C08染色體上，其中C03染色體分布最多，存在29個位點，單個 SNP對表型的解釋率為 1.31%～30.62%；關(guān)聯(lián)分析檢測到與硫代葡萄糖苷含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記最少，為27個，分布在A02、A09、C02、C05、C06與C09染色體上，單個標(biāo)記對表型的解釋率為1.62% ～ 25.92%。

圖3 3個品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.3 The genome-wide association analysis of three quality traits

3 結(jié)論與討論

通過分析104份甘藍型油菜自交系的芥酸、油酸與硫代葡萄糖苷含量3個品質(zhì)性狀，發(fā)現(xiàn)性狀的變異系數(shù)均在30%以上；相關(guān)性分析表明，芥酸含量與硫代葡萄糖苷含量呈極顯著正相關(guān)，油酸含量與芥酸、硫代葡萄糖苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與王健勝等[22]的研究結(jié)果一致；因此，在甘藍型油菜品種選育中，可考慮以高芥酸與高硫代葡萄糖苷含量，高油酸與低芥酸、低硫代葡萄糖苷含量的材料作為育種親本。

前人[23]在進行全基因組關(guān)聯(lián)分析時發(fā)現(xiàn)，群體內(nèi)部的親緣關(guān)系矩陣與群體結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致較高假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；因此，需采用群體結(jié)構(gòu)矩陣Q與親緣關(guān)系矩陣作為協(xié)方差矩陣，對關(guān)聯(lián)分析進行校正。本研究中，通過群體結(jié)構(gòu)分析，可將104份材料分為 4個亞群。采用混合線性模型分析性狀與標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)程度，發(fā)現(xiàn)與芥酸、油酸、硫代葡萄糖苷含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點數(shù)分別為42、61、27。

本研究通過GWAS檢測到與芥酸、油酸含量顯著關(guān)聯(lián)的位點主要集中在A08、C03染色體上，與硫代葡萄糖苷含量顯著關(guān)聯(lián)的位點主要分布在A02、A09、C09染色體上。葉桑等[24]通過對重組自交系群體(RIL)構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)在A05、A08與C03染色體上存在多種脂肪酸含量的QTL“富集區(qū)域”。LI等[25]通過關(guān)聯(lián)分析，檢測到A08與 C03染色體上存在 2個控制芥酸含量的基因。李施蒙[26]利用SNP芯片對520份甘藍型油菜的油酸含量進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要在A08、C03染色體上檢測到與油酸含量顯著關(guān)聯(lián)的位點。本研究中檢測到與油酸顯著關(guān)聯(lián)的位點主要集中在A08、C03上，這表明在A08、C03染色體上確實存在控制油酸含量的基因位點，可作為改良油菜籽中脂肪酸組成的重要區(qū)段。