許恒毅， 余 雙， 李 暉， 朱新根， 張晶晶

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌大學(xué)，江西 南昌330047）

隨著納米技術(shù)、核酸自組裝技術(shù)和生物傳感器技術(shù)等研究的不斷深入，發(fā)展基于其的新分析方法和技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物更快速，更靈敏和更準(zhǔn)確的檢測已成為科研工作者面臨的新挑戰(zhàn)[1]?；跓晒庑盘柕臋z測方法因具有靈敏度高，特異性強(qiáng)及定量精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，受到生物，化工，醫(yī)藥等領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注[2]。由于常規(guī)基于熒光的檢測手段中，信號分子與被檢物一般以1∶1的比例結(jié)合，無法實(shí)現(xiàn)對痕量目標(biāo)物的檢測，因此其檢測靈敏度受到一定的限制。為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度，研究者們構(gòu)建了一系列核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大檢測平臺，廣泛應(yīng)用于檢測核酸、蛋白質(zhì)、微生物等。作者對核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法在生物樣品檢測中應(yīng)用的情況進(jìn)行了綜述，旨在為該方法在實(shí)際檢測中的應(yīng)用研究提供參考。

1 核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法的分類

核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法是指通過目標(biāo)物觸發(fā)或阻斷核酸雜交反應(yīng)，引起核酸雜交產(chǎn)物上標(biāo)記的熒光信號分子數(shù)目發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物定量檢測的方法。其主要特點(diǎn)是：反應(yīng)過程中單個目標(biāo)物的存在即可引起多個信號分子的熒光值發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號放大。根據(jù)熒光信號分子與核酸結(jié)合方式的不同，該方法可分為嵌入型和修飾型兩類。為方便讀者理解，圖1以雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）介導(dǎo)的幾種熒光信號放大方法為例進(jìn)行說明。

圖1 幾種HCR介導(dǎo)的熒光信號放大方法Fig.1 HCR-mediated fluorescence signal amplification methods

1.1 嵌入型

嵌入型熒光信號放大方法是指基于熒光信號分子嵌入核酸引起體系熒光信號發(fā)生變化的信號放大方法，其原理是：當(dāng)目標(biāo)物存在時，引發(fā)或阻斷核酸分子雜交，使核酸分子中熒光信號分子的嵌入量改變，從而引起熒光信號發(fā)生變化。該類方法常用到的熒光信號分子包括核酸熒光嵌入型染料和金屬納米團(tuán)簇兩種。核酸熒光嵌入型染料是指能通過與堿基或磷酸骨架結(jié)合嵌入DNA或RNA分子中的熒光染料，其中常用的核酸熒光嵌入型染料有7類，分別為:菲錠類熒光染料，雙苯并咪唑及與其搭配使用的熒光染料，4，6-二氨基-2-苯基吲哚，色霉素A3和光神霉素，哌洛寧，海藻類蛋白和菁染料[3]。金屬納米團(tuán)簇是由幾個到幾十個金屬原子構(gòu)成的相對穩(wěn)定納米聚集體，粒徑一般小于2 nm，因制備過程簡便，熒光產(chǎn)率高，已被廣泛應(yīng)用于生物、化工等研究領(lǐng)域。

1.2 修飾型

隨著生物體基因庫的完善，人工設(shè)計及合成工藝的提高，熒光探針設(shè)計與合成技術(shù)得到了飛速發(fā)展。由于核酸雜交的可設(shè)計性和高特異性，核酸熒光探針技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物樣品的檢測。熒光探針法檢測原理一般分為兩種:（1）直接檢測，通過將熒光基團(tuán)直接標(biāo)記于核酸探針末端或中端，當(dāng)目標(biāo)物存在時，引發(fā)或阻斷核酸雜交反應(yīng)，從而引起熒光信號發(fā)生變化；（2）基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）， 通過將熒光基團(tuán)標(biāo)記于核酸分子一端形成熒光核酸探針，目標(biāo)物引發(fā)或阻斷核酸雜交反應(yīng)，熒光基團(tuán)與熒光淬滅分子的距離發(fā)生變化，引發(fā)或阻斷FRET，從而引起熒光信號發(fā)生變化[4]。該類方法中，常見的熒光探針一般通過修飾熒光染料制備，但常見的熒光染料存在光穩(wěn)定性差的缺陷，因此開發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光材料用于合成熒光核酸探針具有重大意義。量子點(diǎn)（Quantum dot，QD）作為一種新型的納米材料，具有顏色豐富，穩(wěn)定性好，熒光強(qiáng)度高和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，且有研究表明QD可穩(wěn)定標(biāo)記在肽鏈或脫氧核糖核苷酸長鏈上[5-6]，因此有望替代傳統(tǒng)熒光染料，用于合成核酸熒光探針，克服傳統(tǒng)熒光染料易光漂白的缺陷。

2 核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法的應(yīng)用

核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法已成為生物樣品檢測的熱門方法，由于該方法具有設(shè)計靈活，特異性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種目標(biāo)物的檢測，如細(xì)菌，核酸，蛋白質(zhì)，生物小分子和無機(jī)金屬離子等。表1詳細(xì)總結(jié)了核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法在不同目標(biāo)物檢測中的應(yīng)用。

2.1 細(xì)菌全菌檢測

細(xì)菌檢測在食品，醫(yī)藥和環(huán)境安全等領(lǐng)域意義重大，傳統(tǒng)微生物檢測方法耗時長，工作量大，難以適應(yīng)快速檢測的需求[22]，核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法作為一種快速靈敏的檢測手段能有效實(shí)現(xiàn)細(xì)菌檢測。根據(jù)識別機(jī)制的不同，基于核酸雜交的熒光信號放大方法在細(xì)菌全菌檢測中的應(yīng)用主要分為抗原抗體識別型和核酸適配體識別型兩類:（1）抗原抗體識別型，該類方法通過特異性抗體識別細(xì)菌，從而觸發(fā)或阻斷核酸雜交反應(yīng)，引起體系熒光信號值變化，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的定量檢測。Wen等[23]建立了一種基于催化發(fā)夾型DNA自組裝反應(yīng)（Catalyzed hairpin assembly，CHA） 的雙抗夾心免疫法用于檢測河水中的希瓦氏菌，在此研究中，巧妙設(shè)計3個末端修飾有脫硫生物素的發(fā)夾探針，經(jīng)過CHA反應(yīng)，形成大量量子點(diǎn)的聚合物，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號放大的目的，該方法對目標(biāo)菌的最低檢測限為1.37 CFU/mL，且具有較好的重現(xiàn)性（原理圖見圖2（a））。 （2）核酸適配體識別型，該類方法通過特異性核酸適配體識別細(xì)菌，觸發(fā)或阻斷核酸雜交反應(yīng)，引起熒光信號值變化，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的定量檢測。Zhang等[24]構(gòu)建了一種基于觸發(fā)序列誘導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增技術(shù) （Trigger sequence-induced strand displacement amplification，T-SDA）和銀納米簇的方法用于檢測鼠傷寒沙門氏菌，該研究首先合成一段與目標(biāo)物的適配體部分互補(bǔ)配對的DNA序列，當(dāng)目標(biāo)菌存在時，適配體與目標(biāo)菌特異性結(jié)合，游離的互補(bǔ)鏈觸發(fā)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，形成一條較長的雙鏈 DNA （Double-stranded DNA，dsDNA），Ag+在NaBH4的作用下以dsDNA為模板還原為銀納米簇，通過記錄銀納米簇的熒光信號實(shí)現(xiàn)對活的鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，其最低檢測限為50 CFU/mL，且該方法能有效區(qū)分活死菌，達(dá)到只檢測活菌的目的。Leng等[25]構(gòu)建了一種基于核酸適配體和靶向觸發(fā)的酶修復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)（Target-triggered enzymatic repairing amplification，ERA）的熒光信號放大方法成功用于檢測鼠傷寒沙門氏菌。該研究通過靶標(biāo)與適配體特異性結(jié)合反應(yīng)，將包埋于dsDNA中的ERA引發(fā)鏈暴露出來，在聚合酶和兩種DNA修復(fù)酶的協(xié)助下，引發(fā)ERA循環(huán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)熒光信號放大的目的。該方法在10～5×106CFU/mL目標(biāo)菌濃度下具有較好的線性范圍，最低檢測限為9.86 CFU/mL，且對人工污染的牛奶樣本檢測發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的回收率，原理見圖 2（b）[23，25]。

表1 核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法在不同樣本檢測中的應(yīng)用Table 1 The application of nucleic acid hybridization mediated fluorescence signal amplification methods for the detection of different samples

2.2 核酸檢測

核酸檢測在醫(yī)療診斷、法醫(yī)分析、基因表達(dá)和藥物發(fā)現(xiàn)等科學(xué)領(lǐng)域至關(guān)重要。然而，一般情況下，特定序列（基因）的核酸通常是微量存在的，常規(guī)檢測方法無法實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)序列進(jìn)行痕量檢測。因此，作為一種高效，超靈敏的檢測手段，基于核酸雜交的熒光信號放大方法被廣泛應(yīng)用于微小核糖核酸（miRNAs）和DNA等的檢測。miRNAs是長約22 nt的非編碼單鏈RNA分子，通過與信使RNA（mRNA）結(jié)合阻斷基因表達(dá)，其異常表達(dá)與一些癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[26-28]，因此建立靈敏，特異的檢測平臺實(shí)現(xiàn)對miRNAs的監(jiān)測具有重要意義。Yuan等[29]合成了一種核酸功能化量子點(diǎn)探針，通過目標(biāo)miRNA在量子點(diǎn)表面引發(fā)CHA反應(yīng)形成G-四聯(lián)體，結(jié)合氯化血紅素（hemin）形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體/血紅素酶，最終在hemin和G-四聯(lián)體/血紅素酶的共同作用下淬滅量子點(diǎn)熒光，實(shí)現(xiàn)對靶miRNA的檢測，最低檢測限達(dá)到37 fmol/L（原理圖見圖3（a））。Hong等[30]建立了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增的熒光信號放大方法用于靈敏檢測miRNA-21。該方法通過目標(biāo)miRNA-21誘導(dǎo)CHA反應(yīng)形成不同比例的單鏈DNA（Single-stranded DNA，ssDNA），dsDNA 熒光探針，并巧妙地利用氧化石墨烯對ssDNA和dsDNA親和力差異及熒光淬滅特性，通過測定體系熒光信號實(shí)現(xiàn)對miRNA-21的檢測，最低檢測限為0.4pmol/L[29，32]。

圖2 抗原抗體識別型核酸信號放大方法檢測細(xì)菌原理圖，適配子識別型核酸信號放大方法檢測細(xì)菌原理圖Fig 2 Illustrationofnucleicacidsignalamplificationmethodsbasedonantigen-antibody(a)andaptamer(b)recognitionsforthe detectionofbacteria

圖3 核酸雜交信號放大方法在核酸檢測中應(yīng)用原理圖Fig.3 Illustrationofapplicationofnucleicacidhybridization signal amplification method in nucleic acid detection

DNA是一類帶有遺傳信息的生物大分子，由于DNA分子堿基互補(bǔ)配對的特性，基于DNA構(gòu)建的檢測方法均具有靈敏度高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷，微生物檢測和基因分析等領(lǐng)域。Yu等[31]通過不對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）和HCR雙重?zé)晒庑盘柗糯髾C(jī)制，聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)用于超靈敏檢測蠟樣芽孢桿菌，結(jié)果顯示，該方法在純培養(yǎng)液和牛奶中蠟樣芽孢桿菌的最低檢測限分別為7.6 CFU/mL和9.2×102CFU/mL，與其余非目的菌未見交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出優(yōu)良的特異性。相比傳統(tǒng)未經(jīng)信號放大的熒光檢測方法，靈敏度顯著提高。Zhang等[32]建立了一種基于氧化石墨烯結(jié)合HCR反應(yīng)的熒光信號放大方法用于檢測HIV-DNA。該方法利用HIV-DNA引發(fā)HCR反應(yīng)，并以發(fā)夾探針末端C序列上的銀納米簇為熒光信號輸出分子，利用GO與ssDNA和dsDNA親和力差異及熒光淬滅特性，實(shí)現(xiàn)定量檢測HIV-DNA的目的，該方法在HIV-DNA濃度為10 nmol/L到100 nmol/L時具有良好的線性關(guān)系，對HIVDNA的最低檢測限為1.18 nmol/L，且能有效地識別單堿基突變（原理圖見圖3（b））。

2.3 蛋白質(zhì)檢測

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與生參與生物體大部分生命活動，作為生命體的重要調(diào)控物質(zhì)，其含量變化對生物體健康具有重要影響，建立靈敏的蛋白質(zhì)檢測方法具有重要意義。基于核酸雜交的熒光信號放大方法因操作簡單，靈敏度高，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測。根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)與核酸分子的結(jié)合方式的不同，該方法可分為3類:（1）利用特異性抗體（原理見圖 4（a）），Xu 等[33]采用雙抗夾心免疫法結(jié)合HCR反應(yīng)用于檢測甲胎蛋白（Alpha fetal protein，AFP），該研究利用碳量子點(diǎn)作為熒光信號輸出分子，當(dāng)有AFP存在時，抗體與之特異性結(jié)合引發(fā)HCR反應(yīng)，最后通過檢測HCR產(chǎn)物上熒光信號實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。該方法對AFP的最低檢測限為94.3 fg/mL，其靈敏度顯著高于傳統(tǒng)免疫學(xué)方法，且具有較好的特異性。（2）利用特異性核酸適配體（原理見圖 4（b）），Li等[34]利用 HCR 反應(yīng)與金納米粒子建立了一種靈敏檢測前梯度蛋白2同系物（Anterior gradient homolog 2，AGR2）的方法。此研究中，AGR2的適配體觸發(fā)兩個末端修飾FAM的DNA發(fā)夾探針發(fā)生HCR反應(yīng)，當(dāng)AGR2存在時，AGR2與其適配體特異性結(jié)合，HCR反應(yīng)被阻斷，剩余的發(fā)夾探針吸附于納米金表面，發(fā)夾探針末端的熒光被淬滅。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法具有較好的特異性，線性范圍為5.0 pmol/L到1.0 nmol/L，對AGR2的檢測靈敏度可達(dá)到2.65 pmol/L。（3）利用蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)（原理見圖 4（c）），Jiang 等[35]建立了一種基于DNA酶和HCR反應(yīng)的方法檢測DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶 （DNA adenine methyltransferase，Dam MTase）。該研究中，HCR反應(yīng)的引發(fā)鏈被包埋于一個含有DNA甲基化酶作用位點(diǎn)的發(fā)夾探針中，在Dam MTase的作用下，引發(fā)鏈游離出來，觸發(fā)HCR反應(yīng)，形成大量能特異性切斷兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的熒光探針的DNA酶，從而改變熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離，阻斷FRET效應(yīng)，使熒光信號值發(fā)生變化。該方法對Dam MTase的最低檢測限為7.23×10-4U/mL，且對濃度為1.0×10-3～100 U/mL的Dam MTase具有良好的線性，相比其他信號放大方法，該方法具有更寬的線性范圍。

2.4 生物小分子檢測

核酸雜交介導(dǎo)的熒光信號放大方法主要通過結(jié)合核酸適配體技術(shù)實(shí)現(xiàn)對生物小分子的檢測。Wang等[36]利用HCR反應(yīng)合成DNA樹突狀聚合物，大量熒光苝探針在DNA誘導(dǎo)下聚集引起熒光淬滅，并將赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）特異性核酸適配體將該聚合物固定于磁珠表面，當(dāng)OTA存在時，由于核酸適配體和OTA之間的強(qiáng)親和力，復(fù)合物從磁性納米粒子中釋放出來，在乙醇的作用下，PAPDI單體解聚并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，該方法檢測靈敏度為0.1 pmol/L，且具有良好的特異性和回收率。Feng等[37]建立了一種基于核酸適配體和HCR技術(shù)的熒光信號放大方法用于檢測腺苷，該研究將腺苷核酸適配體分為兩部分，當(dāng)腺苷存在時，暴露的引發(fā)鏈觸發(fā)HCR反應(yīng)，形成dsDNA，熒光染料SYBR Green I插入dsDNA，產(chǎn)生熒光信號。該方法在腺苷濃度為 1.0×10-6～1.2×10-4mol/L 具有較好的線性關(guān)系，其檢測靈敏度為2.0×10-7mol/L。Taghdisi等[38]利用鏈霉素適配體和Exonuclease III建立了一種熒光信號放大方法用于檢測鏈霉素。該方法通過鏈霉素與鏈霉素適配體發(fā)生親和反應(yīng)，產(chǎn)生不同濃度的ssDNA和dsDNA，并巧妙地利用Exonuclease III特異性水解dsDNA，通過SYBR Gold染料插入ssDNA，引起體系熒光值發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)對鏈霉素的定量檢測，該方法對緩沖液，血液和牛奶中鏈霉素的最低檢測限分別為 54.5、71.0、76.1 nmol/L，具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。

2.5 無機(jī)金屬離子檢測

重金屬離子廣泛存在于空氣，土壤和水等基質(zhì)中，難以被生物降解，通過食物鏈的生物放大作用能在人體中富集，并與人體內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用，使蛋白質(zhì)功能受損，造成人體慢性中毒，因此，實(shí)現(xiàn)對其的實(shí)時監(jiān)控具有重要意義[39]。目前，常規(guī)儀器分析法檢測雖然靈敏度高，但需要借助大型儀器，成本高且無法滿足實(shí)時檢測的需要。而基于核酸雜交的熒光信號放大方法不僅能實(shí)現(xiàn)對其精確定量，而且可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場監(jiān)測，因而得到了多數(shù)研究者的青睞。Lv等[40]構(gòu)建了一種基于HCR的熒光信號放大方法用于Hg2+的檢測，當(dāng)Hg2+存在時，由于T-Hg2+-T配對作用，引發(fā)兩個末端修飾FAM的發(fā)夾探針發(fā)生HCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)熒光信號放大，該方法對Hg2+的檢測靈敏度可達(dá)0.36 nmol/L，且具有良好的特異性（原理見圖5）。Huang等[41]聯(lián)合氧化石墨烯和HCR反應(yīng)構(gòu)建了一種熒光信號放大方法用于檢測Hg2+，該方法對Hg2+的最低檢測限為0.3 nmol/L，且對其它二價金屬離子表現(xiàn)出高選擇性。Chen等[42]利用Cu2+依賴性DNA酶和FRET效應(yīng)設(shè)計了一個熒光傳感器檢測Cu2+。該方法對Cu2+的最低檢測限為0.5 nmol/L，線性范圍為1～100 nmol/L，且具有較好的特異性。

圖4 抗原抗體識別型核酸信號放大方法檢測蛋白質(zhì)原理圖，適配子識別型核酸信號放大方法檢測蛋白質(zhì)原理圖，蛋白質(zhì)功能性質(zhì)介導(dǎo)的核酸信號放大方法檢測蛋白質(zhì)原理圖Fig.4 Illustration of nucleic acid signal amplification methods based on antigen-antibody(a)and aptamer(b)recognitions and the function of protein(c)for the detection of protein

圖5 核酸雜交信號放大方法在Hg2+檢測中應(yīng)用原理圖Fig.5 Illustration of application of nucleic acid hybridization signalamplification method in Hg2+detection

3 展望

核酸雜交技術(shù)的熒光信號放大方法在實(shí)際應(yīng)用中仍存在以下問題:（1）實(shí)際檢測樣本中基質(zhì)復(fù)雜，對檢測結(jié)果干擾嚴(yán)重；（2）核酸雜交效率不高影響檢測靈敏度；（3）熒光信號穩(wěn)定性弱，易光漂白。鑒于上述問題，一方面，未來的研究方向可集中于對樣品前處理技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，同時開發(fā)能準(zhǔn)確評估核酸探針反應(yīng)效率的核酸設(shè)計軟件，系統(tǒng)分析體系中各實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響，進(jìn)而提高反應(yīng)效率和抗干擾能力。另一方面，開發(fā)新型熒光信號分子或結(jié)合其他核酸雜交技術(shù)用于構(gòu)建熒光信號放大方法，進(jìn)一步提高檢測靈敏度，實(shí)現(xiàn)更有效地監(jiān)測生物樣本中目標(biāo)物含量的目的。隨著核酸雜交技術(shù)和納米技術(shù)的不斷發(fā)展，基于核酸雜交的熒光信號放大方法在生物檢測領(lǐng)域必將擁有廣闊的應(yīng)用前景。