周王艷，韋顯星，高 溯，楊 金，李 博，王曉琴，卜春亞**

(1.北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)，是一種多食性世界性害螨，因其宿主廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖迅速，嚴(yán)重危害農(nóng)林經(jīng)濟(jì)作物[1]。螨害輕則植株生長不良，重則整植株死亡[2]。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶[3-5]。AChE是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標(biāo)[6-7]，這類農(nóng)藥與AChE活性中心部位不可逆地結(jié)合，抑制酶水解，使ACh大量積累，受持續(xù)性刺激，進(jìn)而抽搐性死亡[8]，但該類農(nóng)藥常難降解且靶向性差，對(duì)非靶標(biāo)有益生物存在威脅。

不同生物間AChE較保守，但存在一定差異。比較不同物種AChE差異，以此構(gòu)建AChE突變型，為研制和篩選選擇性強(qiáng)的新型殺螨劑提供依據(jù)，這在蟲害防治中具重大意義[9]。2016年，Wang等[10]對(duì)家蠶AChE進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)一步研究了突變與農(nóng)藥抗性和特異性之間的關(guān)聯(lián)。2015年韓晶玉等[11]對(duì)朱砂葉螨AChE進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)建模，通過對(duì)比該螨AChE與人AChE功能位點(diǎn)以及周圍區(qū)域氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的差異性，找出了4個(gè)差異位點(diǎn)E316W，W156Y，V105Y，H369G，初步推斷這4個(gè)位點(diǎn)可能是螨AChE特有作用位點(diǎn)。本研究以此為理論依據(jù)，將朱砂葉螨AChE三點(diǎn)突變型V105Y/W156Y/E316W和W156Y/E316W/H369G，即位點(diǎn)VWE和WEH，插入pET-30a載體上進(jìn)行體外表達(dá)，并純化AChE突變型蛋白，并與野生型蛋白活性進(jìn)行差異分析，可為篩選新型選擇性殺螨劑提供試驗(yàn)指向。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株與載體：Trans1-T1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞和pEasy-T1克隆載體均購自北京全式金生物有限公司，pET-30a載體為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：Primer STAR、EcoR I、XhoI購自Takara公司；TIANpure Mini Plasmid Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；T4 DNA Ligase購自北京全式金生物有限公司；Protease Inhibitor Cocktail、eECL試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因擴(kuò)增 以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的朱砂葉螨去疏水區(qū)的AChE突變型pCold II/ace質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)帶有EcoR I、XhoI位點(diǎn)的引物1ace-F：5’CCGCTCGAGAATGTTTTCTCCTCC3’和引物2 ace-R：5’CGCGAATTCCTAATTTGATGATCC 3’，PCR法擴(kuò)增ace突變型基因，產(chǎn)物電泳分離鑒定，用試劑盒TIANgel Midi Purification Kit回收。

1.2.2 載體構(gòu)建 將回收的ace片段連接T1載體轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選陽性，經(jīng)菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證無誤，提取陽性質(zhì)粒，進(jìn)一步送測序鑒定。取測序正確的T1-ace質(zhì)粒和pET-30a載體分別用EcoR I和XhoI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將其拼接后導(dǎo)入E.coliDH5α，進(jìn)行驗(yàn)證，即完成pET-30a/ace突變型載體構(gòu)建。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.3 誘導(dǎo)表達(dá) 將1.2.2構(gòu)建好的E.coliBL21(DE3)陽性菌株劃線活化，挑取單菌落于3 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min活化培養(yǎng)3 h后，接入新LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長期時(shí)加IPTG在37 ℃下誘導(dǎo)7 h后，收集菌體于-80 ℃保存。并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，AChE突變型重組蛋白的大小約為66 kDa。

1.2.4 蛋白分離純化 取收集的菌體，以20 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)重懸后，加入20 μL 1U/μL DNase、200 μL 10 mg/mL 溶菌酶、200 μL Protease Inhibitor Cocktail(100×)和200 μL 10 mg/mL PMSF，于4 ℃混合預(yù)裂解1 h，再經(jīng)超聲破碎儀破碎至溶液呈清亮米黃色，4 ℃，7 800 r/min離心收集并取上清，加入已平衡的Ni-NTA柱料于4 ℃結(jié)合2 h，后分步洗脫，測OD280nm值，收集流出峰，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.5 AChE突變型重組蛋白的Western Blot鑒定 對(duì)獲得蛋白的AChE特異性進(jìn)行確認(rèn)，將獲得的蛋白電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。按照康為世紀(jì)一步法eECL試劑盒操作，以兔源抗AChE多克隆抗體作一抗，結(jié)合二抗孵育45 min后漂洗，再以eECL曝光顯影。將鑒定正確的組分蛋白超濾濃縮，置換50 mM的Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液。按Thermo Scientific公司BCA試劑盒操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線，測蛋白樣品的蛋白濃度。

以野生型的酶活性為100%，換算突變型的活性。將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比對(duì)分析AChE野生型與突變型的酶活力差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體T1-ace突變型的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增ace突變型基因，PCR產(chǎn)物電泳檢測，產(chǎn)物大小與目的片段一致，將擴(kuò)增片段分離進(jìn)行膠回收。將回收的擴(kuò)增片段連接到T1載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性菌株，提取質(zhì)粒用EcoR I和XhoI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，獲得的2個(gè)片段的大小符合(圖1)，將陽性質(zhì)粒送測，測序正確，表明成功構(gòu)建了T1-ace突變型。

注：M.DNA Marker III 1.T1-ace/VWE；2.T1-ace/WEH Note: M. DNA Marker III 1. T1-ace/VWE; 2. T1-ace/WEH圖1 T1-ace 突變型質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion identification of T1-ace mutants

2.2 pET-30a/ace突變型重組載體構(gòu)建

取測序正確的T1-ace突變型質(zhì)粒和pET-30a空載體，分別以EcoR I和XhoI進(jìn)行雙酶切后，膠回收雙酶切產(chǎn)物。用T4連接酶將回收的目的基因與pET-30a載體拼接，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)中，篩選陽性菌株，菌液PCR檢測正確后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，切割的片段大小為5 422 bp和1 782 bp(圖2)，符合pET-30a載體與目的基因的大小，即重組載體連接成功。再將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送測，進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因序列是否正確，結(jié)果表明測序正確，ace基因兩突變型的突變點(diǎn)分別為W156Y/E316W/H369G和V105Y/W156Y/E316W同預(yù)期突變位點(diǎn)相符，即目的重組載體構(gòu)建成功。

注：M.DNA Marker III; 1.pET-30a/ace/VWE 雙酶切2.pET-30a/ace/WEH 雙酶切 Note: M.DNA Marker III; 1. pET-30a/ace/VWE; 2. pET-30a/ace/WEH圖2 pET-30a/ace 突變型(DH5α)質(zhì)粒的雙酶切Fig.2 Restriction enzyme analysis of pET-30a/ace mutants

2.3 目的蛋白的表達(dá)與純化

將測序成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽性菌株進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增出的片段與ace突變型基因大小一致，表明重組載體成功導(dǎo)入BL21(DE3)中，表達(dá)菌株構(gòu)建完成。體外誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白和Ni-NTA柱結(jié)合，梯度咪唑緩沖液洗脫純化后，對(duì)流出峰樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(圖3)。由泳道1～2可看出在誘導(dǎo)7 h后有一個(gè)大小約為66 kDa的蛋白大量表達(dá)；泳道3～5看出，收集的菌體破碎后上清中存在大量的該蛋白，即誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白具有較好的水溶性。用梯度濃度咪唑進(jìn)行洗脫，由泳道7～9知，在200 mM的咪唑洗脫液中有明顯的目的條帶，其大小在66 kDa左右同目的蛋白大小一致，即成功純化出表達(dá)的重組蛋白。

注：a：AChE-VWE 重組蛋白；b：AChE-WEH 重組蛋白；M：蛋白 Marker；1：IPGT誘導(dǎo)0 h的全菌；2：IPTG誘導(dǎo)7 h的全菌；3：菌體破碎后離心的上清液；4：菌體破碎后離心的沉淀；5：結(jié)合Ni-NTA后的穿透液；6：40 mM咪唑洗脫的收集液； 7～9：200 mM咪唑洗脫的收集液Note:a. AChE-VWE recombinant protein; b. AChE-WEH recombinant protein; M. Protein Marker; 1. 0 h IPGT induction of whole bacteria; 2. 7 h IPTG induction of whole bacteria; 3. Supernatant, 4. Precipitate; 5. solutionnot binding with Ni-NTA; 6. 40 mM imidazole elution, 7-9. 200 mM imidazole elution圖3 AChE突變型誘導(dǎo)表達(dá)純化的SDS-PAGE鑒定Fig.3 SDS-PAGE identification of induced expression and purification of AChE recombinant protein

2.4 目的蛋白的Western Blot分析

對(duì)純化的重組蛋白，進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在66 kDa處成功顯影一條特異條帶(圖4)，說明表達(dá)出的蛋白具有AChE特異性。

注：M.蛋白maker；1.AChE-VWE重組蛋白；2.AChE-WEH 重組蛋白Note:M. protein maker; 1. AChE-VWE recombinant protein;2. AChE-WEH recombinant protein圖4 重組蛋白的Western Blot結(jié)果Fig.4 Western Blot analysis of AChE recombinant protein

2.5 重組蛋白的活性分析

對(duì)純化后的目的蛋白，以改良Ellman法測重組蛋白的活性，采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法分析野生型與突變型的活性差異。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變型的活性雖降低但差異不顯著(圖5)。說明AChE蛋白在VWE和WEH的位點(diǎn)突變后，仍然具有活性。

注：ace/1 782.朱砂葉螨AChE野生型；VWE、WEH.朱砂葉螨AChE突變型；a.代表差異性顯著水平，標(biāo)記字母相同表示相互間差異不顯著Note:ace/1 782.Tetranychus cinnabarinus AChE wild type;VWE，WEH. Tetranychus cinnabarinus AChE mutant.a. represents the significant level of difference, and the same letter of the mark means that the difference between them is not significant圖5 朱砂葉螨AChE野生型與突變型酶活力對(duì)比分析Fig.5 Comparative analysis of enzyme activities of Tetranychus cinnabarinus AChE wild type withthe mutants

3 討 論

朱砂葉螨這類害螨，對(duì)殺螨劑易產(chǎn)生抗藥性。乙酰膽堿酯酶是生物體重要的神經(jīng)酶，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有十分重要作用，主要集中分布于蟲體的頭部與胸部[12]。AChE作為農(nóng)藥作用靶標(biāo)，通過抑制AChE水解作用，導(dǎo)致ACh過多累積于突觸，致使害螨因神經(jīng)沖動(dòng)、肌肉抽搐而死亡。

與傳統(tǒng)殺螨劑相比，新型殺螨劑以不同種屬AChE活性位點(diǎn)的差異來研發(fā)選擇性強(qiáng)的殺螨劑，該殺螨劑選擇性強(qiáng)，對(duì)害螨具較強(qiáng)毒性，減少對(duì)非靶標(biāo)生物毒害性?，F(xiàn)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作用位點(diǎn)，是靶標(biāo)與非靶標(biāo)生物共有的，在大面積使用過程中易對(duì)人畜等非靶標(biāo)生物造成一定影響。并且有機(jī)磷農(nóng)藥經(jīng)土壤、水等媒介，通過富集作用進(jìn)入體內(nèi)，并暴露、積累和殘留在環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)造成破壞[13]。在近年的環(huán)境報(bào)道中，農(nóng)藥在殺死害蟲的同時(shí)也會(huì)誤殺非靶標(biāo)昆蟲——蜜蜂，一種高經(jīng)濟(jì)效益昆蟲資源，在作物授粉保產(chǎn)增產(chǎn)中具重要意義，因此篩選出選擇性強(qiáng)的殺螨劑是十分具有必要性的。

另一方面減緩螨的抗藥性問題，隨著殺蟲劑長期濫用及過度依賴，導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗藥性[14-15]并可遺傳[16]。據(jù)近年調(diào)查與組學(xué)數(shù)據(jù)檢測結(jié)果表明[17]，隨著有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的大量濫用，可導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生顯著抗藥性，AChE對(duì)殺蟲劑的敏感下降，其根本原因?yàn)锳ChE基因發(fā)生突變[18]。2013年，王舉梅對(duì)家蠶ace1進(jìn)行三點(diǎn)突變，并得到突變前后對(duì)農(nóng)藥的敏感性有明顯變化[19]；2018年，楊茜對(duì)家蠅抗藥性與ace基因突變分析，檢測得到突變頻率較高位點(diǎn)[20]。突變對(duì)昆蟲的抗藥性有一定影響，但因突變位點(diǎn)不同，改變幅度大小有差異。生物之間的AChE比較保守[21]，以此相互對(duì)比。

為篩選出具新型高特異性的殺螨劑，可利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)螨特異性位點(diǎn)進(jìn)行篩選，以此來鑒定殺螨劑特異性的差異。對(duì)比突變型VWE和WEH的蛋白活性發(fā)現(xiàn)二者活性都存在不同程度的降低，但沒有達(dá)到顯著水平，可能不同位點(diǎn)之間存在互補(bǔ)關(guān)系。

本研究成功構(gòu)建pET-30a/ace表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)AChE突變型原核高效表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建，純化得到較高純度目的重組蛋白。通過測定AChE突變型活性，對(duì)比野生型有所降低但并無顯著差異，結(jié)果表明這兩種突變型未符合目的條件。但這為AChE功能和結(jié)構(gòu)研究提供相應(yīng)依據(jù)，同時(shí)為今后對(duì)于新型殺螨劑的篩選提供一定的創(chuàng)新性思路，也為后續(xù)大量深入研究奠定基礎(chǔ)。