賈慧慧，王超男，魏艷敏，趙曉燕，高坦坦，任爭光*

(北京農(nóng)學院a.農(nóng)業(yè)應用新技術北京市重點實驗室/植物生產(chǎn)國家級實驗教學示范中心，b.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京102206)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)普遍存在于植物的根際土壤中，具有綠色、抑菌譜廣、耐儲藏、耐逆境等特點，是植物保護工作者進行生物防治研究的一類重要微生物[1]。解淀粉芽胞桿菌能夠合成多種抗菌代謝產(chǎn)物，其中，以非核糖體合成的聚酮化合物、脂肽化合物和核糖體合成的細菌素為主[2-3]。利用這些抗菌代謝產(chǎn)物，解淀粉芽胞桿菌能夠抑制多種病原真菌和細菌的生長。另外，解淀粉芽胞桿菌與植物的相互作用可誘導植物產(chǎn)生誘導系統(tǒng)抗性(Induced systemic resistance, ISR)，使植物抗病性增強[4]。北京農(nóng)學院植物保護實驗室前期從杏樹根際土壤分離到一株解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)BJ-6，研究發(fā)現(xiàn)該菌株及其發(fā)酵液對蘋果樹皮腐爛病菌(Valsamali)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、桃褐腐病菌(Monilinialaxa)和白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)等多種病原真菌具有很強的抑菌活性[5-6]。本研究對解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組進行測序、基因預測與功能注釋，分析抗菌代謝產(chǎn)物的合成基因簇，并驗證部分抗菌物質合成基因的表達，為今后深入研究該菌株的拮抗機制提供保障。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株B.amyloliquefaciensBJ-6分離自北京市門頭溝區(qū)杏樹根際土壤，北京農(nóng)學院植物保護實驗室保存。供試LB培養(yǎng)基配方為酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min；NB培養(yǎng)基配方為牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，調節(jié)pH至7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 細菌總DNA和RNA的提取 將解淀粉芽胞桿菌BJ-6用LB培養(yǎng)基于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h，收集菌體，采用細菌基因組提取試劑盒(購自北京博邁德基因技術有限公司)提取總DNA。將解淀粉芽胞桿菌BJ-6菌株接種到NB培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)60 h，并分別于12、24、36、48、60 h時取樣，利用細菌RNA提取試劑盒(購自北京博邁德基因技術有限公司)提取解淀粉芽胞桿菌BJ-6不同時間段的總RNA。

1.2.2 基因組測序與組裝 細菌DNA檢測合格后送北京賽默百合生物科技有限公司進行全基因組測序。采用全基因組鳥槍法(Whole-genome shotgun, WGS)，構建不同插入片段的文庫，基于illumina MiSeq測序平臺進行測序，獲得的原始數(shù)據(jù)采用Edena軟件進行組裝[7]。

1.2.3 基因預測及注釋 使用Prodigal軟件對序列的蛋白編碼區(qū)(Coding sequence, CDS)進行預測，使用Infernal、Rnammer軟件對tRNA、rRNA和ncRNA進行預測[8-9]。使用RFam、Nr、KEGG、Swissprot和Nt數(shù)據(jù)庫對所有基因進行比對和功能注釋[10-11]。通過antiSMASH軟件進行抗菌次級代謝產(chǎn)物基因簇的預測[12]。

1.2.4 抗菌代謝產(chǎn)物主要合成基因轉錄分析 將1.2.1中提取的總RNA利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。反轉錄體系為20 μL，包括反轉錄酶緩沖液4 μL、反轉錄酶1 μL、Oligo(dT)引物1 μL、隨機核苷酸引物1 μL。反轉錄程序為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，使得反轉錄酶失活，最后4 ℃保存。根據(jù)次級代謝產(chǎn)物抗菌基因簇的預測結果，以cDNA為模板，設計7對引物(表1)分別擴增抗菌代謝產(chǎn)物(豐原素、桿菌素、大環(huán)內酯抗生素、桿菌溶素、兒茶酚型嗜鐵素、表面活性素和伊枯草菌素)合成相關基因的部分序列(200 bp左右)；設計1對引物(表1)擴增細胞壁組分糖醛酸磷壁酸質的合成基因作為對照；同時以解淀粉芽胞桿菌BJ-6總DNA為模板作為對照進行擴增。分析不同培養(yǎng)時間段(12～60 h)抗菌代謝產(chǎn)物合成基因的轉錄表達情況。

表1 用于擴增解淀粉芽胞桿菌BJ-6抗菌代謝產(chǎn)物合成基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for amplifying biosynthesis genes of antibiotic metabolite

2 結 果

2.1 解淀粉芽胞桿菌BJ-6基因組序列結構特征

經(jīng)過全基因組測序，序列拼接比對和注釋分析，最后得到解淀粉芽胞桿菌BJ-6的全基因組序列4 175 709 bp。該序列GC含量為46.12%，預測的蛋白編碼區(qū)(CDS)為4 075個；最后注釋基因4 261個，包括87個tRNA基因、13個rRNA基因、1個tmRNA和85個miscRNA基因；基因間區(qū)占12.04%，基因的平均長度862 bp，基因的GC含量平均為47.21%；基因間區(qū)GC含量為38.22%，基因間區(qū)平均長度118 bp；共找到154個串聯(lián)重復區(qū)域，10個IS序列，5個噬菌體元件。將解淀粉芽胞桿菌BJ-6與已公開發(fā)表解淀粉芽胞桿菌FZB42(GenBank登錄號：CP000560)[13]進行比較，相對于FZB42，解淀粉芽胞桿菌BJ-6基因組較大，編碼蛋白基因數(shù)量也多，而GC含量、編碼區(qū)占比和IS序列數(shù)量基本一致(表2)。

表2 解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組序列基本特征及菌株FZB42的對比結果Tab.2 The features of whole genome sequences of B. amyloliquefaciens BJ-6 and FZB42

2.2 主要代謝途徑功能基因分析

KEGG分析解淀粉芽胞桿菌BJ-6基因組中主要代謝途徑基因，有20種主要代謝通路，對參與各代謝通路的基因數(shù)量進行統(tǒng)計，見圖1。參與氨基酸代謝和碳水化合物代謝的基因較多，都在200個以上；其次是參與跨膜運輸、輔助因子和維生素代謝的基因；萜類和聚酮化合物，以及其他次級代謝物生物合成的數(shù)量共有74個，其中包括該菌株產(chǎn)生抗菌物質的合成基因。

圖1 解淀粉芽胞桿菌BJ-6主要代謝通路注釋統(tǒng)計Fig.1 Annotation graph of B. amyloliquefaciens BJ-6 protein encoding gene KEGG pathway

2.3 抗菌代謝產(chǎn)物基因簇的分析

通過antiSMASH軟件對解淀粉芽胞桿菌BJ-6抗菌代謝產(chǎn)物編碼基因簇進行預測(表3)。在解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組中預測到7個抑菌代謝產(chǎn)物編碼基因簇，其中豐原素、桿菌溶素、表面活性素，兒茶酚型嗜鐵素和伊枯草菌素是通過非核糖體途徑(Nonribosomal peptidesynthesis, NRPS)合成，桿菌素和大環(huán)內酯抗生素通過聚酮化合物途徑(Polyketide biosynthase, PKS)合成。除表面活性素外，其他基因簇均與模式菌株FZB42具有極高的同源性，相似度均達到100%(表3)。這些基因簇編碼合成的物質具有抗病毒、抗細菌、抗真菌和累積鐵離子等功能活性。進一步將解淀粉芽胞桿菌BJ-6的表面活性素合成基因簇與FZB42的相關合成基因簇(srfAA-srfAB-srfAC-srfAD)進行全序列比對，相對于FZB42的表面活性素合成基因簇，解淀粉芽胞桿菌BJ-6的表面活性素合成基因序列大量缺失，但是剩余序列仍和FZB42的合成基因簇相關序列高度同源(圖2)。

表3 解淀粉芽胞桿菌BJ-6編碼的抗菌物質Tab.3 Gene clusters of antibiotic secondary metabolites of B. amyloliquefaciens BJ-6

圖2 解淀粉芽胞桿菌BJ-6與模式菌株FZB42的表面活性素合成基因簇比對分析結果Fig.2 Comparison of the surfactin biosynthesis gene clusters between B. amyloliquefaciens BJ-6 and FZB42

2.4 基因轉錄分析

為了驗證抗菌物質合成基因在解淀粉芽胞桿菌BJ-6中是否正常表達，對不同培養(yǎng)時間的解淀粉芽胞桿菌BJ-6總RNA進行提取，并反轉錄成cDNA，以此為模板，通過設計引物分別擴增抗菌物質合成基因。解淀粉芽胞桿菌BJ-6在NB中培養(yǎng)12～60 h，以不同時間段的cDNA為模板，均擴增到豐原素、桿菌素、大環(huán)內酯抗生素、桿菌溶素、兒茶酚型嗜鐵素、表面活性素和伊枯草菌素的合成基因目的片段，說明這些抗菌物質合成基因能夠正常表達(圖3)。

3 討 論

隨著DNA測序技術的革新和基因組學研究的發(fā)展，越來越多的芽胞桿菌全基因組被測序，截止目前在NCBI網(wǎng)站公布的芽胞桿菌全基因組有200多個，其中包括枯草芽胞桿菌51株，解淀粉芽胞桿菌18株，這些生物學信息為研究生防芽胞桿菌提供重要的依據(jù)。本研究對解淀粉芽胞桿菌BJ-6全基因組進行測序，獲得大小為4 175 709 bp的序列，序列的GC含量為46.12%，預測編碼區(qū)4 075個，加上各種RNA基因共4 261個。與模式解淀粉芽胞桿菌FZB42相比，解淀粉芽胞桿菌BJ-6序列更大，編碼蛋白基因數(shù)更多。通過KEGG數(shù)據(jù)庫預測到解淀粉芽胞桿菌BJ-6的主要代謝通路共20種，antiSMASH軟件預測次級代謝抗菌化合物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)豐原素、桿菌素、大環(huán)內酯抗生素、桿菌溶素、兒茶酚型嗜鐵素、表面活性素和伊枯草菌素這7種抗菌化合物的合成基因簇。另外，還發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌BJ-6的表面活性素合成基因簇與模式菌株FZB42的相關合成基因簇序列存在較大差異。對解淀粉芽胞桿菌BJ-6的RNA進行提取并反轉錄成cDNA，以cDNA模板進行PCR擴增，這7種抗菌物質的關鍵合成基因都能正常表達。這為下一步鑒定解淀粉芽胞桿菌BJ-6產(chǎn)生的抗菌物質種類奠定基礎。