劉邵陽，白辰，徐競男，黃羚，高飛，駱長永，姜欣，于河，谷曉紅，劉鐵鋼

基于網絡藥理學方法探索達原飲治療發(fā)熱作用機制

劉邵陽，白辰，徐競男，黃羚，高飛，駱長永，姜欣，于河，谷曉紅，劉鐵鋼

北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

運用網絡藥理學方法對達原飲進行分析，探索達原飲治療發(fā)熱的相關靶點與通路，明確其作用機制與潛在治療疾病，為后續(xù)研究提供指導。通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索達原飲各組成藥物的主要化學成分及作用靶點，參考類藥五原則并結合口服生物利用度對成分靶點數(shù)據(jù)進行篩選，通過String數(shù)據(jù)庫檢索篩選后的靶點，得到達原飲作用靶點基因，在CTD數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)熱（fever）相關作用靶點基因，對二者進行比較分析，取重復值，得到達原飲治療發(fā)熱相關靶點；在String數(shù)據(jù)庫中檢索達原飲治療發(fā)熱相關靶點，得到達原飲治療發(fā)熱相關通路；利用Cytoscape3.7.0軟件對通路進行模塊化分析，選擇分值最高者，在WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit中進行可視化分析。得到達原飲治療發(fā)熱相關靶點432個，相關通路75條，其中特異性疾病相關通路21條，非特異性疾病相關通路54條。達原飲治療發(fā)熱的作用機制涉及以代謝為中心的多種途徑，可能通過多靶點復雜通路的共同干預起效。本研究就達原飲對于癌性發(fā)熱的治療補充了數(shù)據(jù)支持，并推測達原飲治療神經退行性疾病具有可能性。

達原飲；發(fā)熱；網絡藥理學

達原飲出自明代吳又可《溫疫論》，由“檳榔（二錢），厚樸（一錢），草果仁（五分），知母（一錢），芍藥（一錢），黃芩（一錢），甘草（五分）”組成，主治“溫疫初起，先憎寒而后發(fā)熱，日后但熱而無憎寒也。初得之二三日，其脈不浮不沉而數(shù)，晝夜發(fā)熱，日晡益甚，頭疼身痛”[1]，具有開達膜原、辟穢化濁功效。臨床研究表明，達原飲治療發(fā)熱性疾病療效優(yōu)于抗菌、抗病毒藥，可用于多種類型發(fā)熱的治療，如感染性發(fā)熱、濕熱型發(fā)熱、持續(xù)性發(fā)熱、高熱、傍晚后發(fā)熱、間斷發(fā)熱、低熱等，特別是對感染性發(fā)熱和濕熱型發(fā)熱具有更重要的作用[2]。實驗研究顯示，達原飲具有顯著的解熱作用，且能平穩(wěn)降溫，無高低起伏之弊，其作用機制可能是通過降低腦脊液的前列腺素E2含量，從而減少對體溫中樞的興奮性刺激，或與降低血清白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平及肝組織髓過氧化物酶活性有關[3-4]。

達原飲治療發(fā)熱療效確切，但其作用機制尚缺乏系統(tǒng)全面研究。網絡藥理學基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡，系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，從而揭示藥物協(xié)同作用于人體的機理[5]。本研究運用網絡藥理學方法建立達原飲治療發(fā)熱的相關靶點數(shù)據(jù)庫，構建靶點基因與通路的網絡關系，進而分析相關病理通路，總結歸納達原飲治療發(fā)熱的相關作用機制，并探討其潛在治療疾病。

1 資料與方法

1.1 達原飲作用靶點確定

登錄中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），在“HERB”項中分別查詢達原飲各組成藥物（檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草），得到藥物的主要化學成分，構建達原飲化學成分數(shù)據(jù)庫；檢索達原飲各化學成分對應的作用靶點，構建達原飲作用靶點數(shù)據(jù)庫；將上述2個數(shù)據(jù)庫的內容進行合并處理，得到以中藥、成分、靶點為主要內容的達原飲成分-靶點初步數(shù)據(jù)。參考類藥五原則，并結合口服生物利用度（OB），對達原飲成分靶點數(shù)據(jù)進行篩選。設置篩選參數(shù)為：分子量（MW）＜500，氫鍵給體數(shù)目（Hdon）＜5，氫鍵受體數(shù)目（Hacc）＜10，OB＞30%。對篩選結果以靶點名稱為基準刪除重復值，得到達原飲相關靶點。登錄蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫String（http://string-db.org/），選擇“multiple names”，輸入上述達原飲相關靶點名稱，選擇物種為“homo sapiens”進行檢索，在Exports一欄中得到達原飲作用靶點。

1.2 發(fā)熱相關靶點確定

通過疾病基因數(shù)據(jù)庫CTD（http://ctdbase.org/）檢索疾病“fever”，得到發(fā)熱相關靶點。

1.3 達原飲治療發(fā)熱相關靶點確定

將達原飲作用靶點與發(fā)熱相關靶點進行比較分析，取二者交集，即為達原飲治療發(fā)熱相關靶點。

1.4 達原飲治療發(fā)熱相關靶點網絡關系構建

在String數(shù)據(jù)庫中錄入達原飲治療發(fā)熱相關靶點，在“organism”中選擇“homo sapiens”進行檢索，獲得蛋白相互作用關系等生物信息。將數(shù)據(jù)導入網絡可視化工具Cytoscape3.7.0軟件，獲得分子相互作用關系，并進行模塊化分析。

1.5 達原飲與發(fā)熱相關通路富集分析

使用Cytoscape3.7.0軟件進行模塊化分析后，對得分較高的基因組進行整理，在注釋及富集分析數(shù)據(jù)庫DAVID中對達原飲治療發(fā)熱相關通路進行GO和KEGG富集分析，使用在線基因分析工具WebGestalt（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit）進行生物進程和功能的可視化分析。

2 結果

2.1 達原飲治療發(fā)熱相關靶點

檢索得到達原飲作用靶點436個，發(fā)熱相關靶點26 168個，二者比較分析后取重復值，得到達原飲治療發(fā)熱相關靶點432個。

2.2 達原飲治療發(fā)熱靶點網絡關系

在String數(shù)據(jù)庫中獲得6471條達原飲治療發(fā)熱相關靶點基因間作用關系，得到相應靶蛋白關系圖。使用Cytoscape3.7.0軟件進行模塊化處理后獲得16個基因模塊。結果見圖1、圖2。

2.3 達原飲治療發(fā)熱靶點富集分析

對達原飲治療發(fā)熱靶點模塊化處理結果中的模塊1進行GO富集分析，獲得生物進程、細胞成分、分子功能三方面內容，結果見圖3。涉及生物進程共12類，按其所涉及基因數(shù)目從多到少依次為：代謝過程、生物調節(jié)、刺激反應、多細胞有機進程、發(fā)育進程、定位、細胞通訊、組織細胞組成、細胞增殖、多組織過程、繁殖、生長；涉及細胞成分共21類，按其所涉及基因數(shù)目從多到少依次為：細胞膜、細胞小泡、細胞液、細胞核、膜封閉腔、內膜系統(tǒng)、高分子復合物、線粒體、細胞外空間、內質網、細胞投影、膜、高爾基體、細胞骨架、染色體、內涵體、液泡、細胞外基質、微體、核糖體、脂質顆粒；涉及分子功能共17類，按其所涉及基因數(shù)目從多到少依次為：蛋白結合、離子結合、轉移酶活性、水解酶活性、核苷酸結合、核酸結合、分子轉導活性、脂質結合、轉運活性、酶活性調控、染色質結合、抗氧化活性、電子載體活性、糖結合、氧結合、結構分子活性、分子適應活性。

圖1 達原飲治療發(fā)熱相關靶蛋白關系圖

圖2 達原飲治療發(fā)熱靶蛋白模塊分析結果

圖3 達原飲治療發(fā)熱靶點模塊1富集分析

2.4 達原飲治療發(fā)熱相關通路KEGG富集分析

經KEGG富集分析，共獲得達原飲治療發(fā)熱相關通路75條，見圖4。其中，特異性疾病相關通路21條，分別涉及前列腺癌、胰腺癌、結直腸癌、非小細胞性肺癌、膀胱癌、小細胞肺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、腎細胞癌、膠質瘤、黑色素瘤、慢性粒細胞白血病、急性髓細胞白血病等諸多癌癥途徑，阿爾茨海默病、亨廷頓病、朊粒病、肌萎縮側索硬化癥等神經系統(tǒng)疾病，以及幽門螺桿菌感染、同種異體移植排斥反應與2型糖尿病。本研究以“發(fā)熱”為研究點，特異性疾病的通路較非特異性疾病通路更具有針對性，容易使結果分析產生偏倚，故對非特異性疾病通路進行深入分析。非特異性疾病相關通路共54條，見表1?？煞譃榱?，其中代謝相關32條，免疫相關8條，內分泌相關5條，環(huán)境信息處理5條，細胞過程3條，神經系統(tǒng)相關1條。

圖4 達原飲治療發(fā)熱相關KEGG通路

表1 達原飲治療發(fā)熱非特異性疾病相關通路

ID通路名稱相關基因數(shù) ID通路名稱相關基因數(shù) hsa04080Neuroactive ligand-receptor interaction28 hsa00620Pyruvate metabolism12 hsa00330Arginine and proline metabolism26 hsa00830Retinol metabolism12 hsa00980Metabolism of xenobiotics by cytochrome P45023 hsa00270Cysteine and methionine metabolism11 hsa00982Drug metabolism21 hsa04622RIG-I-like receptor signaling pathway11 hsa04920Adipocytokine signaling pathway19 hsa00500Starch and sucrose metabolism10 hsa04620Toll-like receptor signaling pathway19 hsa00140Steroid hormone biosynthesis10 hsa04722Neurotrophin signaling pathway19 hsa04662B cell receptor signaling pathway10 hsa00260Glycine, serine and threonine metabolism18 hsa00591Linoleic acid metabolism 9 hsa04910Insulin signaling pathway18 hsa04610Complement and coagulation cascades 9 hsa04020Calcium signaling pathway18 hsa00860Porphyrin and chlorophyll metabolism 8 hsa00590Arachidonic acid metabolism17 hsa00983Drug metabolism 8 hsa04370VEGF signaling pathway17 hsa00030Pentose phosphate pathway 7 hsa03320PPAR signaling pathway16 hsa00052Galactose metabolism 7 hsa04660T cell receptor signaling pathway16 hsa00340Histidine metabolism 7 hsa00350Tyrosine metabolism15 hsa00640Propanoate metabolism 7 hsa04115p53 signaling pathway15 hsa00071Fatty acid metabolism 7 hsa04912GnRH signaling pathway15 hsa04672Intestinal immune network for IgA production 7 hsa00480Glutathione metabolism14 hsa00360Phenylalanine metabolism 6 hsa04664Fc epsilon RI signaling pathway14 hsa00910Nitrogen metabolism 6 hsa04110Cell cycle14 hsa00410beta-Alanine metabolism 5 hsa00380Tryptophan metabolism13 hsa00450Selenoamino acid metabolism 5 hsa00010Glycolysis / Gluconeogenesis13 hsa00670One carbon pool by folate 4 hsa04621NOD-like receptor signaling pathway13 hsa04614Renin-angiotensin system 4 hsa04914Progesterone-mediated oocyte maturation13 hsa00053Ascorbate and aldarate metabolism 4 hsa04210Apoptosis13 hsa00400Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis 3 hsa04012ErbB signaling pathway13 hsa00680Methane metabolism 3 hsa00250Alanine, aspartate and glutamate metabolism12 hsa00460Cyanoamino acid metabolism 3

3 討論

吳又可在達原飲方后闡釋方義言：“檳榔能消能磨，除伏邪，為疏利之藥，又除嶺南瘴氣；厚樸破戾氣所結；草果辛烈氣雄，除伏邪盤踞。三味協(xié)力，直達其巢穴，使邪氣潰敗，速離膜原，是以為達原也。熱傷津液，加知母以滋陰；熱傷營血，加白芍以和血；黃芩清燥熱之余；甘草為和中之用。”[1]諸藥合用，使邪熱得清，津血得復，邪氣潰敗，速離膜原，具有開達膜原、辟穢化濁的功用。清代醫(yī)家謝星煥《得心集醫(yī)案》卷六痙厥門載有達原飲治療小兒發(fā)熱一案，辨為溫瘧，運用達原飲加減治療，使熱勢得以控制[6]。

發(fā)熱是指機體在致熱原作用下或各種原因引起體溫調節(jié)中樞功能障礙時，體溫升高超出正常范圍。外源性致熱源如細菌內毒素，通過激活血液中的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核吞噬細胞系統(tǒng)，使其產生并釋放內源性致熱源，如白細胞介素、腫瘤壞死因子和干擾素等，進而通過中樞介質引起發(fā)熱。

達原飲治療發(fā)熱相關靶點共有432個，相關作用通路共75條。其中特異性疾病相關通路21條，非特異性疾病相關通路54條。由GO富集與KEGG富集結果可知，達原飲治療發(fā)熱所參與的生物進程重點集中于代謝過程。54條非特異疾病相關通路中，代謝相關通路32條，涉及藥物、外源物質、多種氨基酸、糖、脂質、輔助因子和維生素、能量、淀粉與蔗糖、氮等多種物質的代謝途徑，其他通路分別涉及免疫、內分泌、環(huán)境信息處理、細胞過程及神經系統(tǒng)。

21條特異性疾病相關通路中，癌癥通路（hsa05200：Pathways in cancer）相關基因數(shù)量明顯高于其他通路，且特異性疾病中包含前列腺癌、胰腺癌、結直腸癌、非小細胞性肺癌、膀胱癌、小細胞肺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、腎細胞癌、膠質瘤、黑色素瘤、慢性粒細胞白血病、急性髓細胞白血病共13種癌癥。臨床觀察表明運用達原飲加減能有效治療癌性發(fā)熱。如申建中[7]采用達原飲加減治療癌性發(fā)熱42例，與西藥治療40例比較，療效較優(yōu)且無不良反應。張偉[8]采用達原飲加減治療濕熱蘊結型癌性發(fā)熱亦取得較好臨床效果，且作用緩和、平穩(wěn)、不良反應小，耐受性好。本研究采用網絡藥理學方法驗證了達原飲對于癌性發(fā)熱的治療作用，推測達原飲在治療癌性發(fā)熱方面具有作用傾向性，因而會產生較好的治療效果，提示臨床可進一步深入研究達原飲對于癌性發(fā)熱的治療應用。

非特異性疾病相關通路中涉及1條神經系統(tǒng)信號通路hsa04722：Neurotrophin signaling pathway（神經營養(yǎng)素信號通路）。神經營養(yǎng)素是參與神經細胞分化和存活的營養(yǎng)因子，神經營養(yǎng)素家族由神經生長因子、腦源性神經營養(yǎng)因子、神經營養(yǎng)素3、神經營養(yǎng)素4組成，對神經發(fā)育和額外的高階活動如學習和記憶起著重要的作用。特異性疾病中涉及阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經系統(tǒng)退行性疾病。由此推測，達原飲對于神經退行性疾病可能存在治療作用，可進一步發(fā)掘研究。

綜上所述，達原飲治療發(fā)熱的作用機制涉及以代謝為中心的多種途徑，可能通過多靶點復雜通路的共同干預起效。本研究就達原飲對癌性發(fā)熱的治療作用補充了數(shù)據(jù)支持，并推測達原飲治療神經退行性疾病具有可能性。由于中藥化學成分的復雜性，本研究僅從數(shù)據(jù)角度進行闡釋，仍存在很多不足，后期可繼續(xù)完善液相質譜、代謝組學等檢測，通過實驗研究進一步探索與驗證。

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Study on Mechanism ofDecoction in Treating Fever Based on Network Pharmacology

LIU Shaoyang, BAI Chen, XU Jingnan, HUANG Ling, GAO Fei, LUO Changyong, JIANG Xin, YU He, GU Xiaohong, LIU Tiegang

To explore the related targets and mechanism ofDecoction in treating fever by analyzing the prescription with the method of network pharmacology; To clarify the potential therapeutic diseases ofDecoction; To provide guidance for the follow-up study.The main chemical components and action targets of the constituent medicine ofDecoction were retrieved through TCMSP. Component target data were screened based on the five principles of similar medicines and oral bioavailability. The screened targets were retrieved through String database to obtain the target genes ofDecoction. The disease (fever) was searched in the CTD to obtain the relevant target genes. The two were compared and analyzed, and the repeated values were taken to obtain the target related to the treatment of fever byDecoction. The fever-related targets treated byDecoction were retrieved in String, and fever-related pathway ofDecoction was obtained; Cytoscape 3.7.0 was used to perform a modular analysis of these pathways, the one with the highest score was selected, and a visual analysis was performed in the WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit.Totally 432 related targets and 75 related pathways ofDecoction in treating fever were obtained, among which 21 were specific disease-related pathways and 54 were non-specific disease-related pathways.The mechanism ofDecoction in treating fever involves multiple pathways centered on metabolism and the treatment is possibly achieved through joint intervention with multiple targets and complex pathways. This article supplemented the data support forDecoction for the treatment of cancerous fever, and speculated thatDecoction has the possibility of treating neurodegenerative diseases.

Decoction; fever; network pharmacology

R254.2；R285

A

1005-5304(2020)05-0084-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201904168

國家自然科學基金（81403328）；北京市科技專項（Z181100006218083）

劉鐵鋼，E-mail：qaliu76@126.com

（2019-04-12）

（2019-05-22；編輯：陳靜）