張秋艷，黃松麗，張琳婧，梁羽茜，趙丕文，魏勝利，胡秀華

論著·實(shí)驗(yàn)研究

黃芪和天花粉對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和遷移及E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

張秋艷，黃松麗，張琳婧，梁羽茜，趙丕文，魏勝利，胡秀華

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

觀察黃芪、天花粉及其配伍對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和遷移的影響，探討其作用機(jī)制。MTT法檢測B16細(xì)胞增殖，根據(jù)結(jié)果計算細(xì)胞生長抑制率為0%時對應(yīng)的各藥物濃度（IC0）、為25%時對應(yīng)的各藥物濃度（IC25）、為50%時對應(yīng)的各藥物濃度（IC50）。設(shè)空白組、配伍組（黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測B16細(xì)胞遷移，Western blot檢測B16細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin表達(dá)。MTT檢測結(jié)果表明，不同劑量黃芪和天花粉均可抑制B16細(xì)胞增殖，具有濃度依賴性；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪和天花粉均影響B(tài)16細(xì)胞劃痕愈合，抑制細(xì)胞遷移，具有濃度依賴性；兩藥不同比例配伍的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單味中藥，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；Western blot檢測結(jié)果顯示，黃芪和天花粉均增加E-cadherin蛋白的表達(dá)，降低N-cadherin蛋白的表達(dá)。黃芪、天花粉及其配伍均可抑制小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖及遷移，且兩藥配伍效果優(yōu)于單味中藥，黃芪和天花粉抑制細(xì)胞遷移的機(jī)制與E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)相關(guān)。

黃芪；天花粉；B16細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；配伍

惡性黑色素瘤起源于黑色素細(xì)胞的異常增生，是一種發(fā)病率高、惡性程度高、發(fā)展速度快、死亡率高的惡性腫瘤，浸潤和遷移能力強(qiáng)，早期即可向其他部位發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)后極易復(fù)發(fā)。因此，如何有效防治黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，是目前臨床治療惡性黑色素瘤關(guān)注的重點(diǎn)。黃芪和天花粉首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，黃芪有補(bǔ)氣升陽、托毒生肌等功效，其主要成分黃芪多糖能減輕中波紫外線照射對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷[1]。天花粉有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿功效，應(yīng)用于多種外科疾病的治療。臨床及實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃芪和天花粉均有抗炎、抗病毒、抗腫瘤活性，用于多種癌癥的治療[2-8]。此外，中醫(yī)古籍也有黃芪和天花粉聯(lián)合應(yīng)用的案例記載，其中對皮膚癰和癌癥的應(yīng)用為中醫(yī)治療惡性黑色素瘤提供良好的治療經(jīng)驗(yàn)[9]。張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》的消渴名方玉液湯以黃芪為君藥益氣固腎，天花粉為臣藥滋陰生津；陳實(shí)功《外科正宗》載內(nèi)托千金散治療腦疽發(fā)背諸毒惡瘡已成不消者，方中黃芪扶正、天花粉解毒。本研究采用MTT法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測黃芪、天花粉及其配伍對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和遷移的影響，采用Western blot檢測黃芪和天花粉及其配伍對細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床治療惡性黑色素瘤提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心。

1.2 藥物及制備

天花粉購自北京同仁堂藥業(yè)有限公司，批號20180208；黃芪注射液購自黑龍江珍寶島藥業(yè)股份，批號20180604。稱取天花粉100 g，常規(guī)中藥煎煮法煎煮，待藥液煎至約100 mL時將煎液倒入150 mL燒杯，去離子水浸泡，濃縮至50 mL；移至超凈工作臺，將濃縮藥液移至離心管，1000 r/min離心20 min，取上清液，4 ℃密閉保存。取1 mL上清液與2 mL培養(yǎng)基混合注入培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，進(jìn)行檢菌。24 h后觀察培養(yǎng)基，確定藥液無菌后，將藥液4 ℃密閉保存，濃度為2 g/mL。黃芪注射液濃度為2 g/mL，用0.22 μm除菌過濾器過濾，4 ℃密閉保存。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司，貨號11011-8611；DMEM高糖培養(yǎng)基，德國Hyclone公司，貨號SH300243.01b；0.25%胰蛋白酶，德國Hyclone公司，貨號sh30042.01b；PBS，Gibco，貨號20012027；MTT，美國Sigma公司，貨號M8180；DMSO，Sigma公司，貨號d2650；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司，貨號3599；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司，貨號3516；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國Corning公司，貨號430639；RIPA裂解液，北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號c1053；30%丙烯酰胺，北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號b1000-500；5×Loading Buffer，北京索萊寶生物科技有限公司，貨號P1040；吐溫-20，北京索萊寶生物科技有限公司，貨號T8220；BCA蛋白定量試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號CW10045；TEMED，美國Sigma公司，貨號110-18-9；Tris，美國BioRuler公司，貨號77-86-1；SDS，美國BioRuler公司，貨號151-21-3；甘氨酸，美國BioRuler公司，貨號56-40-6；無水甲醇，國藥集團(tuán)；脫脂奶粉，美國BioRuler公司，貨號151-21-3；蛋白彩色預(yù)染marker，Thermo Scientific公司，貨號26616；0.45 μm PVDF膜，美國密理博/默克；N-cadherin，PROTEINTECH GROUP，貨號66219-I-Ig；E-cadherin，PROTEINTECH GROUP，貨號20874-I-AP；抗鼠IgG，PROTEINTECH GROUP，貨號SA00001-1；抗兔IgG，PROTEINTECH GROUP，貨號SA00001-2；ECL超敏發(fā)光液，北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號P1020-100。倒置顯微鏡，日本Olympus公司，micropublisher 5.0 RTV；CO2培養(yǎng)箱，日本松下公司；酶標(biāo)儀，奧地利/Molecular Devices，SpectraMax i3x；凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司，ChemiDoc MP。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測B16細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期B16細(xì)胞，以3×104個/mL濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、黃芪注射液組（終濃度分別為50、100、200、300、400 mg/mL）、天花粉水煎劑組（濃度分別為160、320、640、1280、2560 μg/mL），每組設(shè)5個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸出每孔中藥液，PBS清洗1次，隨后避光條件下，每孔加入濃度為5 mg/ mL的MTT溶液10 μL和90 μL無血清培養(yǎng)基并混合均勻，錫紙包裹靜置，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，然后每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測定吸光度（OD值），計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD值÷空白組OD值）×100%。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別對黃芪注射液、天花粉水煎劑濃度與B16細(xì)胞的抑制率進(jìn)行線性擬合，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)結(jié)果計算出細(xì)胞生長抑制率為0%時對應(yīng)的各藥物濃度（IC0）、細(xì)胞生長抑制率為25%時對應(yīng)的各藥物濃度（IC25）及細(xì)胞生長抑制率為50%時對應(yīng)的各藥物濃度（IC50）。

2.2 MTT法檢測不同比例黃芪和天花粉配伍干預(yù)B16細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期B16細(xì)胞，以3×104個/mL濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、黃芪天花粉配伍組（黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25），每組設(shè)5個平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)、吸光度測定和細(xì)胞抑制率計算同“2.1”項(xiàng)下方法。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測黃芪和天花粉干預(yù)B16細(xì)胞遷移

將對數(shù)生長期B16細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞濃度為3×104個/mL，培養(yǎng)24 h后，用無菌10 μL槍頭在每個孔底部劃出“一”字劃痕，PBS清洗2遍，拍照記錄。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、黃芪注射液組（終濃度為50、100、300 mg/mL）、天花粉水煎劑組（終濃度為160、640、2560 μg/mL），每組設(shè)5個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h后鏡下觀察劃痕愈合度，拍照記錄，并分析細(xì)胞遷移情況。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同比例黃芪和天花粉配伍干預(yù)B16細(xì)胞遷移

將對數(shù)生長期B16細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞濃度為3×104個/mL，培養(yǎng)24 h后，用無菌10 μL槍頭在每個孔底部劃出“一”字劃痕，PBS清洗2次，拍照記錄。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、黃芪注射液組（黃芪注射液IC0、IC25）、天花粉水煎劑組（天花粉水煎劑IC0、IC25、IC50）、黃芪天花粉配伍組（黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25），每組設(shè)5個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后鏡下觀察劃痕愈合度，拍照記錄，并分析細(xì)胞遷移情況。

2.5 Western blot檢測黃芪和天花粉干預(yù)B16細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

將對數(shù)期生長細(xì)胞以5×103個/mL密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組（加含胎牛血清培養(yǎng)基）、黃芪注射液組（黃芪注射液19、158、295 mg/mL）、天花粉水煎劑組（天花粉水煎劑81、762、1595 μg/mL）。48 h后提取蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白組分后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入不同一抗4 ℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，最后用凝膠成像系統(tǒng)掃描成片。用Image J軟件分析目的條帶，每組重復(fù)3次。

2.6 Western blot檢測黃芪和天花粉配伍干預(yù)B16細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

將對數(shù)期生長細(xì)胞以5×103個/mL密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、黃芪天花粉配伍組（黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC50）。48 h后提取蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白組分后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入不同一抗，4 ℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，最后用凝膠成像系統(tǒng)掃描成片。用Image J軟件分析目的條帶，每組重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 不同濃度黃芪和天花粉對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響

藥物處理48 h后，MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度黃芪注射液、天花粉水煎劑對B16細(xì)胞的抑制率不同。黃芪注射液抑制率分別為6.43%、17.36%、26.55%、39.99%、79.90%，與空白組比較，各給藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；天花粉水煎劑抑制率分別為9.17%、20.86%、30.83%、40.67%、81.10%，與空白組比較，各給藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 黃芪和天花粉作用48 h對B16細(xì)胞增殖的影響（n＝3）

組別濃度OD值（±s）抑制率/% 空白組 1.705±0.017 黃芪注射液組 50 mg/mL1.604±0.013* 6.43 100 mg/mL1.409±0.024*17.36 200 mg/mL1.252±0.037*26.55 300 mg/mL1.023±0.108*39.99 400 mg/mL0.343±0.056*79.90 天花粉水煎劑組 160 μg/mL1.549±0.003* 9.17 320 μg/mL1.349±0.003*20.86 640 μg/mL1.179±0.009*30.83 1280 μg/mL1.012±0.096*40.67 2560 μg/mL0.322±0.043*81.10

注：與空白組比較，*＜0.05

根據(jù)結(jié)果計算，黃芪注射液對B16細(xì)胞IC0、IC25、IC50劑量濃度分別為19、158、295 mg/mL；天花粉水煎劑對B16細(xì)胞IC0、IC25、IC50劑量濃度分別為81、762、1595 μg/mL。上述結(jié)果表明，黃芪和天花粉均能明顯抑制B16細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用隨濃度增加而升高，且有濃度依賴性。

4.2 不同比例黃芪和天花粉配伍對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響

藥物處理48 h后，MTT檢測結(jié)果顯示，黃芪天花粉配伍組（黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25）抑制率分別為18.65%、30.39%、51.84%、27.96%、43.27%，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 不同比例黃芪和天花粉配伍作用48 h對B16細(xì)胞增殖的影響（n＝3）

組別 OD值（±s）抑制率/% 空白組1.705±0.017 黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0組1.387±0.077*18.65 黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25組1.187±0.012*30.39 黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50組0.821±0.008*51.84 黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0組1.228±0.141*27.96 黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25組0.967±0.046*43.27

注：與空白組比較，*＜0.05

4.3 不同濃度黃芪和天花粉對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞遷移的影響

培養(yǎng)48 h后，空白組B16細(xì)胞劃痕距離減少，有細(xì)胞遷移運(yùn)動；培養(yǎng)72 h后，空白組B16細(xì)胞劃痕基本愈合。與空白組比較，除黃芪注射液50 mg/mL組外，其他各組劃痕愈合程度均較空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；且隨著天花粉水煎劑和黃芪注射液濃度的增加，劃痕愈合程度越差，細(xì)胞遷移能力越弱，具有劑量依賴性。同時我們發(fā)現(xiàn)不同濃度天花粉水煎劑和黃芪注射液48 h后劃痕愈合程度和72 h后劃痕愈合程度未見明顯差異，無時間依賴性。結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪和天花粉對小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞遷移的影響

4.4 不同比例黃芪和天花粉配伍對B16細(xì)胞遷移的影響

培養(yǎng)72 h后，空白組B16細(xì)胞劃痕愈合明顯。除天花粉水煎劑IC0、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0組外，其余各組較空白組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC0組與黃芪注射液IC0組、天花粉水煎劑IC0組比較無明顯差異，細(xì)胞形態(tài)正常。黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC25組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC0組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎劑IC25組與黃芪注射液IC25、天花粉水煎劑IC25組比較，劃痕愈合程度差，細(xì)胞遷移能力弱，可見部分細(xì)胞死亡，有細(xì)胞碎片形成。天花粉IC50組與黃芪注射液IC0＋天花粉水煎劑IC50組比較，對細(xì)胞遷移抑制程度無明顯差異，但天花粉IC50組細(xì)胞大量死亡，配伍后死亡細(xì)胞量減少。由此可知，黃芪、天花粉及其配伍均能抑制B16細(xì)胞遷移，黃芪和天花粉不同配伍比例對劃痕愈合能力的影響均優(yōu)于相應(yīng)劑量單味中藥，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見圖2。

4.5 黃芪和天花粉對B16細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，762、1595 μg/mL天花粉水煎劑組及黃芪注射液各劑量組E-cadherin蛋白表達(dá)高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；762、1595 μg/mL天花粉水煎劑組及158、295 mg/mL黃芪注射液組N-cadherin蛋白表達(dá)低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見圖3～圖6。

圖3 黃芪和天花粉干預(yù)各組B16細(xì)胞E-cadherin蛋白免疫印跡圖

注：與空白組比較，*P＜0.05

圖5 黃芪和天花粉干預(yù)各組B16細(xì)胞N-cadherin蛋白免疫印跡圖

注：與空白組比較，*P＜0.05

4.6 黃芪和天花粉配伍對B16細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC25組、黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC50組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC0組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC25組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC50組均能降低N-cadherin蛋白表達(dá)（＜0.05）；黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC50組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC25組、黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC50組均能升高E-cadherin蛋白表達(dá)（＜0.05）。其中黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC50組效果最好，對細(xì)胞傷害較小，又能明顯降低N-cadherin、升高E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移，與前期劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。結(jié)果見圖7～圖10。

注：A.空白組；B.黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC50組；C.黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC25組；D.黃芪注射液IC25＋天花粉水煎液IC0組；E.黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC50組；F.黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC25組；G.黃芪注射液IC0＋天花粉水煎液IC0組（下同）

注：與空白組比較，*P＜0.05

圖9 黃芪和天花粉配伍各組B16細(xì)胞E-cadherin蛋白免疫印跡圖

注：與空白組比較，*P＜0.05

5 討論

目前惡性黑色素瘤主要治療方法是通過手術(shù)完全切除病灶，部分拒絕手術(shù)或晚期不能手術(shù)治療患者多采用放療、化療方法，但療效甚微，對機(jī)體損傷大，患者耐受度低，預(yù)后較差。尋求新的治療方法改善患者預(yù)后是目前臨床治療惡性黑色素瘤迫切需要解決的問題。中醫(yī)認(rèn)為，惡性黑色素瘤病因病機(jī)包括氣虛外感、氣滯血瘀等諸多因素，形成機(jī)理以虛損為前提，陽氣束結(jié)或外邪搏于血?dú)舛職鉁龀蔀鹾谀[塊，瘀久化熱，潰爛流膿[10]，治療應(yīng)扶正祛邪。相比于手術(shù)、放化療等對機(jī)體損傷較大的治療方法，中藥在治療惡性黑色素瘤方面歷史悠久，從中尋找治療惡性黑色素瘤的藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。黃芪、天花粉均有抗腫瘤功效，中醫(yī)臨床常將其單獨(dú)或組成各種方劑用于各類中、晚期癌癥患者的治療。單味藥應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性，且高劑量藥物雖對細(xì)胞抑制作用強(qiáng)，但可能在殺死腫瘤細(xì)胞的同時損傷正常細(xì)胞。配伍是中藥治療的主要應(yīng)用方法，多種藥物間配伍不僅能提高療效、減少不良反應(yīng)，也不易產(chǎn)生耐藥性，具有不可忽視的優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪和天花粉配伍不僅能抑制細(xì)胞的增殖和遷移運(yùn)動，還能降低高劑量藥物對細(xì)胞的損傷，配伍后對細(xì)胞增殖的抑制作用與相應(yīng)劑量的單藥相比效果更好。

進(jìn)展迅速是惡性黑色素瘤的主要特性之一，腫瘤細(xì)胞不斷增殖及遷移運(yùn)動，促進(jìn)腫瘤生長，推進(jìn)病程發(fā)展。細(xì)胞增殖需4個階段完成一次增殖周期，每個階段都存在細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)，通過減緩或暫時中止細(xì)胞周期進(jìn)程而提供細(xì)胞足夠時間糾正細(xì)胞周期中的錯誤，只有通過調(diào)控點(diǎn)，細(xì)胞才能進(jìn)入下一階段完成增殖。若細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)失去調(diào)控作用，可造成細(xì)胞生長、分裂失去控制，導(dǎo)致癌癥發(fā)生，中藥抗腫瘤機(jī)制主要為阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，黃芪和天花粉能通過阻滯細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，達(dá)到抗腫瘤作用[11-13]。本研究中MTT結(jié)果表明，黃芪和天花粉單藥及配伍均能抑制惡性黑色素瘤B16細(xì)胞增殖，且兩藥配伍后抑制B16細(xì)胞增殖效果較好。

轉(zhuǎn)移性強(qiáng)是惡性黑色素瘤另一特性，抑制腫瘤細(xì)胞遷移能抑制其進(jìn)一步擴(kuò)散，減緩腫瘤進(jìn)程。相關(guān)研究表明，黑色素瘤細(xì)胞生長過程中，E-cadherin通常被N-cadherin替換，而N-cadherin可促成腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)錄因子snail可活化N-cadherin的表達(dá)，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[14]。本研究中細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Western blot結(jié)果顯示，黃芪和天花粉單藥及配伍均能抑制惡性黑色素瘤B16細(xì)胞遷移，且隨藥物濃度的升高抑制作用增強(qiáng)，具有濃度依賴性。黃芪和天花粉單藥均可增強(qiáng)E-cadherin蛋白表達(dá)，降低N-cadherin蛋白表達(dá)，兩藥配伍后效果更好，與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，說明兩藥起到協(xié)同作用，間接解釋了劃痕實(shí)驗(yàn)中兩藥配伍后B16細(xì)胞愈合能力較單味藥差，兩藥配伍對細(xì)胞遷移的抑制更有效，這與文獻(xiàn)報道中腫瘤遷移的機(jī)制一致[14]。

綜上，黃芪和天花粉能通過抑制小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖及遷移運(yùn)動，抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其抑制細(xì)胞遷移機(jī)制與E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)相關(guān)。此外，不同配伍比例對細(xì)胞增殖和遷移作用不同，部分配伍能在增加對細(xì)胞增殖抑制作用的同時減少對細(xì)胞的損傷，這種抑制增殖的作用是否通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)行仍需進(jìn)一步研究證實(shí)，后期將繼續(xù)研究兩藥配伍后對細(xì)胞增殖和遷移的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床治療惡性黑色素瘤提供依據(jù)。

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Effects of Astragali Radix and Trichosanthis Radix on Cell Proliferation and Migration of Mouse Malignant Melanoma B16 Cells and Expressions of E-cadherin and N-cadherin

ZHANG Qiuyan, HUANG Songli, ZHANG Linjing, LIANG Yuxi, ZHAO Piwen, WEI Shengli, HU Xiuhua

To investigate the effects and mechanisms of Astragali Radix, Trichosanthis Radix and their compatibility on the proliferation and migration of mouse malignant melanoma B16 cells; To discuss its possible mechanism.MTT method was used to detect the proliferation of B16 cells. Based on the results, the drug concentration corresponding to the cell growth inhibition rate of 0% (IC0), the drug concentration corresponding to 25% (IC25), and the drug concentration corresponding to 50% (IC50) were calculated. Blank group and the compatible group (Astragalus IC0+ Trichosanthin IC0, Astragalus IC0+ Trichosanthin IC25, Astragalus IC0+ Trichosanthin IC50, Astragalus IC25+ Trichosanthin IC0, Astragalus IC25+ Trichosanthin IC25) were set. Cell scratch test was used to detect B16 cell migration; Western blot was used to detect the expressions of B16 cell migration related proteins E-cadherin and N-cadherin.MTT results showed that Astragali Radix and Trichosanthis Radixwith different concentrations could inhibit the proliferation of B16 cells in a dose-dependent manner. Results of cell scratch test showed that both Astragali Radix and Trichosanthis Radix would affect the scratch healing of B16 cells, inhibit cell migration, and were concentration-dependent. After the compatibility of Astragali Radix and Trichosanthis Radix, the inhibition rate of cell proliferation was significantly higher than that of the single Chinese materia medica, with statistical significance (<0.05). Western blot results showed that both Astragali Radix and Trichosanthis Radix increased the expression of E-cadherin protein and decreased the expression of N-cadherin protein.Both Astragali Radix and Trichosanthis Radix can inhibit cell proliferation and migration of malignant melanoma B16. The compatibility of Astragali Radix and Trichosanthis Radix have better efficacy than single Chinese materia medica. Its mechanism of inhibiting cell migration may be related to the protein expressions of E-cadherin and N-cadherin.

Astragali Radix; Trichosanthis Radix; B16 cells; cell proliferation; cell migration; compatibility

R285.5

A

1005-5304(2020)05-0028-07

10.3969/j.issn.1005-5304.201910097

國家自然科學(xué)基金（81673764）；北京中醫(yī)藥大學(xué)校級自主課題（2017-JYB-XS-032）；子洲黃芪規(guī)范化種植新技術(shù)開發(fā)研究（2020071720274）

胡秀華，E-mail：xiuhuahu@126.com

（2019-10-09）

（2019-11-01；編輯：華強(qiáng)）