閆希煥，劉 芳，楊梅霞，黃體冉，楊明峰*，馬蘭青,3*

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

樹莓(Rubusidaeus)，又稱覆盆子、木莓和懸鉤子等，是一種薔薇科(Rosaceae)、薔薇亞科(Rosiodeae)、懸鉤子屬(RubusL.)半灌木植物[1]，在中國古代樹莓酮就有很高的食用與藥用價(jià)值，樹莓果實(shí)甘甜可口香氣濃郁可強(qiáng)腎健脾，被記載在中國醫(yī)學(xué)著作《本草綱目》中，在世界醫(yī)學(xué)、保健、科研等領(lǐng)域都占有十分重要的地位[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已證明，樹莓具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老，保護(hù)肝臟和降低血脂，降低血糖、抗菌消炎和止血凝血等作用，在各行各業(yè)被廣泛應(yīng)用[3]。樹莓被列為第三代新興水果，具有眾多的藥理和保健功能，在美國有“紅寶石”“抗癌明星”的美稱[4]。樹莓根據(jù)果實(shí)成熟期不同分為夏果型樹莓與秋果型樹莓，夏果型樹莓一般成熟在6月中旬，秋果型樹莓果期較長，可從7月到10月持續(xù)結(jié)果。

樹莓酮(Raspberry ketone)的分子式是C10H12O2，摩爾質(zhì)量：164.204 G/mol，化學(xué)名為4-對羥基苯基-2-丁酮(4-(4-hydroxyphenyl)-2- butanone)。樹莓酮在常溫下呈現(xiàn)為白色針狀結(jié)晶狀態(tài)，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、乙醚、揮發(fā)性油等有機(jī)溶劑。樹莓酮是樹莓果實(shí)中一種具有代表性的功能化合物，在癌癥、流感、心肌收縮、糖尿病和減肥等方面具有顯著功效[5]，孟憲軍等[6]將樹莓酮應(yīng)用于單純肥胖性的大鼠，證明樹莓酮可在大鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、改善瘦素抵抗和胰島素抵抗等綜合作用來降低大鼠的體質(zhì)量。樹莓酮也是合成萊克多巴胺的原始材料，萊克多巴胺作為一種強(qiáng)心藥，大量應(yīng)用于治療充血性心力衰減癥、肥胖癥和肌肉萎縮等。除此之外，樹莓酮還對增加胰島ρ細(xì)胞中胰島素的表達(dá)[7]、抑制胰腺損傷、促進(jìn)小鼠毛發(fā)的生長及草酸鈣的沉積具有顯著作用[8]。值得特別關(guān)注的是，樹莓酮還是樹莓果實(shí)香氣的主要特征化合物，是一種非常昂貴的天然香料，在美國售價(jià)已達(dá)到2萬美元/kg。樹莓酮香氣清新甘甜、持續(xù)時(shí)間久并且可直接供人們食用，在歐美地區(qū)廣泛用于高檔甜品、冰激凌和化妝品定香劑。

茉莉酸甲酯作為植物體內(nèi)重要的信息素物質(zhì)，是目前應(yīng)用最多的非生物誘導(dǎo)子，可通過誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物合成關(guān)鍵酶的催化反應(yīng)，在植株體上施加信號物質(zhì)，從而促進(jìn)植物防御基因的誘導(dǎo)表達(dá)，刺激次生代謝產(chǎn)物的生成和增加[9]。茉莉酸甲酯在20世紀(jì)60年代被Demole等[10]首次發(fā)現(xiàn)在茉莉?qū)偎剀盎ň椭?。此后，茉莉酸甲酯作為重要的植物激素，廣泛應(yīng)用于果實(shí)品質(zhì)的調(diào)控。孟書亦等[11]將茉莉酸甲酯(50 μmol/L)處理黃岑愈傷組織，其中黃岑苷的含量提高了1.8倍。李文淵等[12]用茉莉酸甲酯(100 μmol/L)處理丹參毛狀根，根中苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酰輔酶A連接酶基因大量表達(dá)，酚類代謝物迅速積累。茉莉酸甲酯(100 μmol/L)處理白及，檢測到5個(gè)苯丙氨酸解氨酶的關(guān)鍵酶活性，在24 h之后高于對照組5倍[13]。對美樂釀酒葡萄葉面噴灑茉莉酸甲酯(10 mmol/L)，增加了20種花色苷物質(zhì)的含量，并促進(jìn)香豆?；ㄉ辗e累時(shí)間的提前[14]。Pedapudi等[15]對樹莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)并用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，檢測到誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞懸浮物中的苯亞甲基丙酮和樹莓酮含量增加了2～4倍。至今茉莉酸甲酯對新鮮的樹莓果實(shí)有什么影響尚不清楚，樹莓酮的提取方法也并不完善[16]。本試驗(yàn)利用新鮮的樹莓果實(shí)，進(jìn)行樹莓酮提取、檢測方法篩選，并在提取、檢測方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行4個(gè)樹莓品種各果期果實(shí)樹莓酮含量檢測，發(fā)現(xiàn)樹莓酮含量最高的果期，對其果實(shí)進(jìn)行茉莉酸甲酯處理，探索茉莉酸甲酯對樹莓酮含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樹莓果實(shí)材料均由中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所董鳳祥提供。品種為：托拉蜜(夏果型，紅色果實(shí)，高香型)、伊瑞木(秋果型，紅色果實(shí)，低香型)、波爾卡(秋果型，紅色果實(shí)，低香型)、橙色傳奇(秋果型，黃色果實(shí)，高香型)。

主要試劑：氯仿、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、樹莓酮標(biāo)品(上海源葉生物有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樹莓果期的選擇及樣品處理 選擇托拉蜜、伊瑞木、波爾卡、橙色傳奇這4個(gè)品種的青果期果實(shí)(15 d)、半熟果期果實(shí)(27 d)、成熟果期果實(shí)(34 d)為供試材料。摘取果實(shí)，放入蒸餾水中浸泡1 min，將果實(shí)泥土污漬沖洗干凈，用濾紙擦干、錫紙包好放入液氮中以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 樹莓酮提取方法的篩選 選用托拉蜜青果期果實(shí)(5 g)、成熟果期果實(shí)(5 g)為試驗(yàn)材料。分為A組、B組、C組、D組，使用30%甲醇、70%水對提取液進(jìn)行高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)檢測。A組45 ℃烘干青果期果實(shí)、成熟果期果實(shí)，氯仿抽提48 h，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，過有機(jī)濾膜。B組液氮研磨青果期果實(shí)、成熟果期果實(shí)，氯仿抽提48 h，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，過有機(jī)濾膜。C組液氮研磨青果期果實(shí)、成熟果期果實(shí)，氯仿抽提48 h，60 ℃溶解2 h，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，過有機(jī)濾膜。D組液氮研磨青果期果實(shí)、成熟果期果實(shí)，氯仿抽提48 h，55 ℃旋蒸成粉末，乙酸乙酯溶解，加入石油醚萃取，4 ℃水除雜，55 ℃旋蒸成粉末，溶于1 mL甲醇，過有機(jī)濾膜。

1.2.3 HPLC方法優(yōu)化 以樹莓酮提取液為材料，使用Waters 1525高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。色譜柱規(guī)格為柱長250 mm的Agilent ZORBAX SB-C18反向色譜柱，檢測樹莓酮過程中設(shè)置色譜柱柱溫35 ℃，查看目標(biāo)峰的吸光值波長為275 nm，流動(dòng)相的流速設(shè)置成1 mL/min，流相為甲醇與水。樣品組設(shè)為樣品Ⅰ組、樣品Ⅱ組、樣品Ⅲ組、樣品Ⅳ組、樣品Ⅴ組。設(shè)置標(biāo)品組為對照Ⅰ組、對照Ⅱ組、對照Ⅲ組、對照Ⅳ組、對照Ⅴ組。標(biāo)品組每組HPLC程序分別對應(yīng)樣品組相同分組的HPLC程序。樣品Ⅰ組：甲醇40%～25%(15 min)，水60%～75%(15 min)；甲醇25%～30%(20 min)，水75%～70%(20 min)；甲醇30%～40%(5 min)，水70%～60%(5 min)。樣品Ⅱ組：甲醇0%～20%(15 min)，水100%～80%(15 min)；甲醇20%～30%(10 min)，水80%～70%(10 min)，甲醇30%～40%(5 min)，水70%～60%(5 min)；甲醇40%～0%(5 min)，水60%～100%(5 min)。樣品Ⅲ組：甲醇20%～30%(15 min)，水80%～70%(15 min)；甲醇30%(20 min)，水70%(20 min)；甲醇30%～20%(5 min)，水70%～80%(5 min)。樣品Ⅳ組：甲醇0%～30%(10 min)，水100%～70%(10 min)；甲醇30%(20 min)，水70%(20 min)；甲醇30%～0%(5 min)，水70%～100%(5 min)。樣品Ⅴ組：甲醇0%～30%(10 min)，0.1%磷酸水100%～70%(10 min)；甲醇30%(20 min)，0.1%磷酸水70%(20 min)；甲醇30%～0%(5 min)，0.1%磷酸水70%～100%(5 min)。

1.2.4 樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將樹莓酮標(biāo)品配成1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 μg/mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上樣10 μL，選?、艚MHPLC方法進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel表格進(jìn)行分析繪制。

1.2.5 不同樹莓品種果實(shí)中樹莓酮含量檢測 選用B組方法對托拉蜜、伊瑞木、波爾卡、橙色傳奇4個(gè)品種的青果期果實(shí)、半熟果期果實(shí)、成熟果期果實(shí)中的樹莓酮進(jìn)行提取檢測，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 茉莉酸甲酯噴灑果實(shí)濃度和時(shí)間 配制茉莉酸甲酯溶液的濃度為0 μmol/L和100 μmol/L (0.1%吐溫20)，分別噴灑托拉蜜、波爾卡、橙色傳奇青果期果實(shí)15、30、90、180 min。將處理好的果實(shí)按照B組方法進(jìn)行樹莓酮提取，以及HPLC檢測樣品Ⅳ組方法進(jìn)行樣品中樹莓酮含量的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓果實(shí)三個(gè)果期

根據(jù)樹莓果實(shí)生長規(guī)律，將樹莓果實(shí)分為三個(gè)果期：青果期、半熟果期、成熟果期(圖1)。

圖1 樹莓不同成熟期的果實(shí)Fig.1 Raspberry fruit at different maturity stages

2.2 樹莓酮不同提取方法的結(jié)果對比

根據(jù)樹莓酮的化學(xué)性質(zhì)，確定4組提取方法，從而優(yōu)化樹莓酮提取效率，減少樹莓酮提取過程中由于提取方法而產(chǎn)生的損失。對樣品45 ℃烘干或60 ℃溫育裂解，都會極大損失樹莓酮含量，并且成熟果期果實(shí)中的樹莓酮更易揮發(fā)。為保證樹莓酮提取過程中雜質(zhì)較少，用乙酸乙酯溶解、石油醚萃取除雜，但提取過程中多次溶解萃取造成樹莓酮含量的減少。液氮研磨，氯仿抽提48 h樹莓酮可檢測到青果期果實(shí)樹莓酮平均含量為7.78 μg/g，成熟果期果實(shí)樹莓酮平均含量4.06 μg/g，目前方法中B組提取效果最好(表1)。

表1 不同提取試驗(yàn)方法對樹莓果實(shí)樹莓酮含量的影響Tab.1 Effect of different extraction methods on raspberry ketone

2.3 樹莓酮高效液相色譜法的確立

樹莓酮易溶于有機(jī)物質(zhì)，不易溶于水，因?yàn)橹参锕麑?shí)中含有大量酚類、酮類、脂類物質(zhì)，所以需要建立一個(gè)完善的HPLC體系，在用時(shí)最短的情況下，使樹莓酮能與其他雜質(zhì)完全分離，出峰穩(wěn)定，檢測效率高。選取B組的提取液對樹莓酮HPLC方法進(jìn)行優(yōu)化，其中樣品Ⅰ組、樣品Ⅱ組、樣品Ⅴ組均未檢測出目標(biāo)峰，磷酸水不利于樹莓酮出峰。樣品Ⅲ組甲醇為20%時(shí)，峰型較小，雜質(zhì)峰相對擁擠。樣品Ⅳ組甲醇為0%～30%時(shí)，雜質(zhì)峰出峰時(shí)間靠前，并且雜質(zhì)峰集中在一塊，與目標(biāo)峰相離較遠(yuǎn)，樹莓酮目標(biāo)峰易于在甲醇為30%時(shí)出峰，并峰型較好，兩邊基線較平穩(wěn)。樣品Ⅳ組檢測效果較好(圖2)。

注：箭頭指向?yàn)闃漭獦悠贩錘ote: Arrow pointing to the raspberry ketone sample peak圖2 樹莓酮HPLC方法檢測Fig.2 HPLC method for detection of raspberry ketone

2.4 HPLC檢測5個(gè)濃度的樹莓酮樣品

樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中縱坐標(biāo)(y)代表5個(gè)不同濃度的樹莓酮標(biāo)品出峰面積，橫坐標(biāo)(x)代表樹莓酮標(biāo)品的5個(gè)濃度，加權(quán)計(jì)算線性回歸方程，方程為y=3711.5x-11525，R2=0.9993(圖3)。

圖3 樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 The standard curve of raspberry ketone

2.5 4個(gè)樹莓品種各果期樹莓酮含量的檢測

對托拉蜜、伊瑞木、波爾卡、橙色傳奇各果期果實(shí)進(jìn)行樹莓酮含量檢測，其中夏果型托拉蜜在半熟果期果實(shí)中樹莓酮含量最高，青果期果實(shí)與成熟果期果實(shí)相差很小，伊瑞木、波爾卡與橙色傳奇青果期果實(shí)樹莓酮含量最高，其中黃樹莓橙色傳奇果實(shí)中樹莓酮含量均高于紅樹莓果實(shí)，青果期果實(shí)樹莓酮含量達(dá)到19.4 μg/g。橙色傳奇青果期果實(shí)樹莓酮含量最高(圖4)。

圖4 不同品種樹莓果實(shí)樹莓酮含量Fig.4 Raspberry ketone content of different varieties

2.6 茉莉酸甲酯(100 μmol/L)噴灑樹莓果實(shí)樹莓酮含量變化

托拉蜜、波爾卡、橙色傳奇青果期果實(shí)經(jīng)100μmol/L的茉莉酸甲酯(0.1%吐溫20)處理15 min，樹莓酮含量達(dá)到最大值。托拉蜜青果期果實(shí)經(jīng)茉莉酸甲酯(100 μmol/L、0.1%吐溫20)噴灑總體呈上升趨勢，波爾卡、橙色傳奇青果期果實(shí)在噴灑15 min后樹莓酮含量開始下降，其中波爾卡青果期果實(shí)在噴灑30 min時(shí)樹莓酮含量最低，大概降低了3倍(圖5)。

圖5 茉莉酸甲酯對樹莓青果期果實(shí)樹莓酮的影響Fig.5 Effect of methyl jasmonate on raspberry ketone in raspberry green fruit

3 討 論

樹莓酮是衡量樹莓果實(shí)品質(zhì)的一個(gè)重要風(fēng)味物質(zhì)，它被發(fā)現(xiàn)在19世紀(jì)20年代，后來人們證明它可以促進(jìn)皮膚感覺神經(jīng)元IGT-I的激活表達(dá)而增強(qiáng)皮膚彈性和頭發(fā)再生[4]。樹莓酮可平衡糖脂代謝、降低蛋白Atg12的表達(dá)，增加血紅素加氧酶1(HO-1)的表達(dá)、瘦素抵抗和胰島素抵抗來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥胖癥，其功效好于奧利司他[17]。Badr等[18]發(fā)現(xiàn)在用乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍前服用樹莓酮(50 mg/kg)，可減少80%的潰瘍面積、由乙醇誘導(dǎo)的TBARs降低了66%，其功效等同于奧美拉唑。樹莓酮在保護(hù)肝臟防止高血壓、高血脂方面也有卓越的功效，例如：提升血清蛋白(APOA-I)含量和降低載脂蛋白B(ApoB)含量[19]。除此之外，樹莓酮還可以抑制α葡萄糖苷的表達(dá)[20]、激活非酒精性脂肪肝中的Nrf2、降低脂質(zhì)過氧化和炎癥介質(zhì)[21]。

茉莉酸甲酯是一種天然植物激素，常用于促進(jìn)植物次生代謝。噴灑茉莉酸甲酯時(shí)黃岑中的查爾酮合酶活性達(dá)到最大值。查爾酮合酶與查爾酮異構(gòu)酶是合成花青素的關(guān)鍵酶，催化4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A形成二羥基黃烷酮，是花青素合成的關(guān)鍵步驟。同樣4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A在苯亞甲基丙酮合酶催化下生成樹莓酮，兩者產(chǎn)生底物競爭關(guān)系。

4 結(jié) 論

根據(jù)樹莓酮化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)行樹莓酮提取化學(xué)方法和HPLC檢測方法探索。可以發(fā)現(xiàn)樹莓酮在高溫下易揮發(fā)，乙酸乙酯和石油醚萃取造成樹莓酮損失，樹莓酮易溶于甲醇，不易溶于水，當(dāng)增大甲醇體積時(shí)，則樹莓酮出峰快，若樣品中含有雜質(zhì)，則應(yīng)控制流動(dòng)相中水與甲醇的體積比例，拉大出峰距離。

檢測一個(gè)品種不同果期樹莓酮的含量，得出夏果型樹莓托拉蜜在半熟果期果實(shí)中樹莓酮含量最高，其余三個(gè)秋果型品種在青果期果實(shí)樹莓酮含量最大，黃樹莓橙色傳奇果實(shí)樹莓酮含量平均高于其他品種3倍。噴灑100 μmol/L的茉莉酸甲酯(0.1%吐溫20)在樹莓青果期果實(shí)上，托拉蜜果實(shí)中樹莓酮含量隨噴灑時(shí)間增加，噴灑15 min時(shí)，樹莓酮含量增加到最大值，波爾卡、橙色傳奇青果期果實(shí)在15 min之后樹莓酮含量開始減少。與未處理果實(shí)相比，樹莓含量整體減少。探索出一套相對完整的樹莓酮提取、HPLC檢測方法，并且通過對樹莓酮的檢測可知，夏果型樹莓果實(shí)樹莓酮在半熟果期含量最高，秋果型樹莓果實(shí)樹莓酮在青果期含量最高，黃樹莓果實(shí)樹莓酮含量高于紅樹莓。