周開明，趙白楊，張丙林，劉衛(wèi)娟，鄒華文

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

非生物脅迫是威脅植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因素之一，例如干旱、高溫、高鹽等逆境。 轉(zhuǎn)錄因子作為具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的調(diào)控因子，在植物非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。 鋅指蛋白是真核生物中較為豐富的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長發(fā)育及非生物脅迫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1～2]。 擬南芥鋅指蛋白基因STZ、ZAT18 被證實(shí)積極參與植株的干旱脅迫響應(yīng)[3～4]。 張彬等對谷子鋅指蛋白基因SiZFP182 的研究發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo)[5]。 在大豆中過量表達(dá)鋅指蛋白基因SCTF-1，轉(zhuǎn)基因株系的耐冷性得到顯著提高[6]。 過量表達(dá)玉米鋅指蛋白基因ZmAN14 的煙草，其苗期的耐鹽性及耐旱性都得到明顯提升[7]。 此外，鋅指蛋白基因還被發(fā)現(xiàn)與多種非生物脅迫相關(guān)。 寧露云等研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛鋅指蛋白基因PhTZF1 的表達(dá)受低溫、干旱、ABA 和高鹽等強(qiáng)烈誘導(dǎo)[8]。 Mukhopadhyay 等研究證實(shí)水稻鋅指蛋白基因OsSAP1 的表達(dá)受低溫、高鹽、重金屬、干旱和激素ABA 等條件的誘導(dǎo)，且過量表達(dá)OsSAP1 基因的煙草，其耐冷、耐鹽及耐干旱水平顯著提高[9]。 而水稻OsZAT12基因的過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系的生長發(fā)育會受到影響[10]。

類LSD1 轉(zhuǎn)錄因子是一類特殊的C2C2 型鋅指蛋白，其特征是含有特殊的鋅指結(jié)構(gòu)(zf-LSD)[11]。 自從Dietrich 首次將LSD1 基因克隆后，對LSD1 基因的功能研究就不斷被報道[11]。Kliebenstein 等的研究表明LSD1 能通過應(yīng)答水楊酸信號通路清除體內(nèi)活性氧，間接抑制細(xì)胞死亡，暗示LSD1 在植物逆境響應(yīng)調(diào)控的作用[12]。 Liu等發(fā)現(xiàn)LSD1 家族中，含有3 個zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域的亞家族成員，其功能性要強(qiáng)于含有1 個或者是2個zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域的亞家族成員，主要的表現(xiàn)是能更多的參與植物細(xì)胞死亡調(diào)控、抗病性和非生物脅迫抗性調(diào)節(jié)[13]。 對苦蕎類LSD1 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析顯示，鋅指蛋白基因FtLSD1、FtLOL1 對非生物脅迫的應(yīng)答強(qiáng)烈[14～15]，猜測該基因可能參與苦蕎抗逆響應(yīng)機(jī)制。 水稻OsLOL2 在擬南芥中的過表達(dá)研究表明，該類LSD1 基因具有提高植物抗鹽堿性的功能[16]。

長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院前期克隆了調(diào)控玉米轉(zhuǎn)脂蛋白基因ZmLTP3 表達(dá)的鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子[17]，并命名為ZmLSD1(GenBank: MH119132. 1)。 該基因長660 bp，編碼219 個氨基酸，含有3 個zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化關(guān)系上與高粱LOL3 蛋白和水稻LOL3 蛋白有較高的親緣關(guān)系。 為深入探究鋅指蛋白基因ZmLSD1 的功能，本研究首先對ZmLSD1 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時運(yùn)用qRTPCR 技術(shù)分析該基因在高溫、低溫、鹽、干旱、脫落酸以及水楊酸處理下的表達(dá)特性。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

玉米B73 自交系，長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1種植與處理 選取大小一致的玉米種子，1%次氯酸鈉消毒5 min，蒸餾水沖洗3 次，置于28 ℃培養(yǎng)箱催芽。 篩選發(fā)芽一致的種子，放入1/4 Hoagland 培養(yǎng)液水培，每7 d 更換2 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至三葉期進(jìn)行處理。 干旱處理為20% PEG 6000 模擬干旱，鹽處理為0.2 mol/L NaCl 溶液，對照組均為正常培養(yǎng)，處理48 h 后取樣；低、高溫處理分別采用4 ℃、42 ℃光照培養(yǎng)箱，對照組均為正常溫度培養(yǎng)，處理4 h 后進(jìn)行取樣；激素處理采用0.1 mol/L 的ABA、SA 進(jìn)行葉面均勻噴施，對照組噴施蒸餾水，處理48 h 后取樣。 取樣部位為幼苗的根、胚芽鞘、葉，液氮速凍后保存于超低溫冰箱中；每個處理設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。

1. 2. 2玉米總RAN 的提取及cDNA 的合成 樣品材料液氮低溫研磨后，參照寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司TRIzol 試劑產(chǎn)品說明方法進(jìn)行總RNA 的提取，1%瓊指糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測。 殘留DNA 的去除以及cDNA 合成采用全式金公司試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，得到的cDNA 使用Thermo NanoDrop One 進(jìn)行濃度測定后暫存于-20 ℃。

1. 2. 3玉米ZmLSD1 基因表達(dá)量分析 采用玉米GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，ZmLSD1 基因的qRT-PCR上下游引物通過Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)，引物委托上海生工進(jìn)行合成(表1)。 試驗(yàn)所使用的SYBR Green I 熒光標(biāo)記染料購于天根生化公司的Real-Universal 彩色熒光定量預(yù)混試劑，熒光定量PCR儀型號為bio-rad CFX connet。 反應(yīng)條件:98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s；40 個循環(huán)。 每個樣品設(shè)置2 個技術(shù)重復(fù)，相對定量的結(jié)果采用2-△△Ct 法進(jìn)行計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1. 2. 4玉米ZmLSD1 基因的生物信息學(xué)分析 在線工具Expasy ProtParam(https:/ /web. expasy.org/protparam/)被用于對ZmLSD1 基因蛋白特性進(jìn)行預(yù)測分析，DNAMAN 軟件進(jìn)行序列比對后使用MEGA-X 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，使用在線工具InterProscan[18](http:/ /www. ebi. ac. uk/interpro/search/sequence-search)分析ZmLSD1 蛋白結(jié)構(gòu)域，蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析則采用在線工具 SOPMA (https:/ /npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? page=npsa_sopma. html)，TMHMM Server v. 2. 0(http:/ /www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/) 被用于跨膜結(jié)構(gòu)分析，ProtScale(https:/ /web. expasy. org/protscale/) 用于分析ZmLSD1 蛋白的親疏水性分析，NetPhos 3.1 (http:/ /www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/)則用于進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析。 Softberry 在線工具protcomp9.0(http:/ /www. softberry. com/berry. phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)進(jìn)行基因的亞細(xì)胞定位。

表 1 引物序列及用途Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2. 1 玉米ZmLSD1 的蛋白序列分析

ProtParam 在線分析顯示，ZmLSD1 基因共編碼 219 個 氨 基 酸， 其 分 子 式 為C978H1607N295O306S23，分子質(zhì)量23 130 u，理論等電點(diǎn)為8.95，總平均親水性0. 057，親水性系數(shù)介于-0.5 到0. 5 之間，屬于兩性氨基酸(圖1，A)。NetPhos 3. 1 在線分析顯示，ZmLSD1 中有20 個Ser 磷酸化位點(diǎn)，9 個Thr 磷酸化位點(diǎn)(圖1，B)。

利用InterProscan 對ZmLSD1 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白中含有3 個zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸51-75、90-114 和128-152 位置。SOPMA 預(yù)測結(jié)果顯示，ZmLSD1 的二級結(jié)構(gòu)中含有的α 螺旋約占10.05%，β 轉(zhuǎn)角約占7.31%，延伸鏈約占30.14%，其余的115 個氨基酸為無規(guī)則卷曲(圖1，C)。 Softberry 在線工具進(jìn)行的蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白最大可能性位于細(xì)胞核。

2. 2 玉米ZmLSD1 的蛋白同源性及進(jìn)化樹分析

在NCBI 蛋白序列比對的結(jié)果表明，ZmLSD1編碼的氨基酸序列與高粱(Sorghumbicolor)LOL3蛋白、水稻(OryzasativaJaponica Group)LOL3 蛋白和小麥(Triticumaestivum)LOL2 蛋白序列相似度較高，相似性分別達(dá)到了94.83 %、77.96 %和73.60 %。 用DNAMAN 軟件將ZmLSD1 蛋白序列與其它物種進(jìn)行蛋白同源性比對分析(圖2)，結(jié)果顯示ZmLSD1 與高粱、水稻、小麥、蕎麥以及擬南芥的鋅指蛋白存在類似結(jié)構(gòu)，其序列中均含有3 個保守的zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域，表明ZmLSD1 屬于典型的鋅指蛋白家族，推測它們具有相似的功能。

基因的進(jìn)化關(guān)系分析顯示(圖3)，ZmLSD1與高粱LOL3、水稻LOL3、水稻LOL2、玉米LOL1和小麥LOL2 的親緣關(guān)系最近。 進(jìn)化樹主要分為3 個分支，LSD1-like 分支中聚集了包括ZmLSD1在內(nèi)的類LSD1 基因，而擬南芥AtSZF1、水稻Os-DOS 和小麥TaTZF1 共同聚集于CCCH 分支，第三分支(C2H2) 則聚集了棉花GaZFP、擬南芥AtAZF2 和水稻OsZFP182 基因。 進(jìn)化樹成員的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，不同分支的鋅指蛋白含有不同的典型結(jié)構(gòu)域，LSD1-like 分支上LSD1 和LOL 類蛋白含有典型的zf-LSD1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，而C2H2 分支和CCCH 分支分別含有典型的zf-C2H2 和zf-CCCH 結(jié)構(gòu)域。

2. 3 玉米ZmLSD1 的表達(dá)特征分析

2. 3. 1ZmLSD1 的組織表達(dá)分析 采用熒光定量PCR 技術(shù)分析ZmLSD1 基因在不同部位中的表達(dá)情況。 結(jié)果表明(圖4)，ZmLSD1 的在葉中的表達(dá)量最高，其次是胚芽鞘，在根中的表達(dá)水平相對較低；該基因在葉中的表達(dá)量是根中表達(dá)量的3. 18 倍，在胚芽鞘中表達(dá)量是根中表達(dá)量的1.55 倍。 推斷ZmLSD1 基因參與調(diào)控表達(dá)的部位以葉為主。

2. 3. 2ZmLSD1 在不同處理下的表達(dá)分析 利用qRT-PCR 分析ZmLSD1 基因在6 種非生物處理下不同植株部位的表達(dá)水平。 根部位的結(jié)果如圖5 顯示，ZmLSD1 基因受低溫、高溫、高鹽、干旱和ABA 處理的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，其中低溫和干旱處理后與對照的相對表達(dá)量分別為5. 47、18. 4，達(dá)到差異極顯著水平；水楊酸處理下該基因的表達(dá)量則降低。 胚芽鞘的檢測結(jié)果表明(圖6)，ZmLSD1 基因在鹽、干旱以及2 種激素(ABA 和SA)的處理下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢，其中干旱脅迫下的相對表達(dá)量為8. 21，差異水平極顯著；而4 ℃和42 ℃溫度處理下該基因的表達(dá)受抑制。ZmLSD1 在葉中的表達(dá)受鹽、干旱和ABA 的影響，其中干旱處理產(chǎn)生的影響最大，而在低溫、高溫和水楊酸條件下該基因表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)(圖7)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZmLSD1 基因?qū)Ω珊?、鹽和ABA 脅迫存在正向響應(yīng)，而低、高溫以及水楊酸環(huán)境能抑制該基因的表達(dá)，但在不同部位中的敏感程度還是存在一定的差異；該基因在根中對干旱、高溫和低溫最敏感，在胚芽鞘中的表達(dá)受干旱和低溫的影響程度最高，在葉中則對鹽和干旱敏感。 結(jié)果表明ZmLSD1 的表達(dá)受干旱、鹽、高溫和低溫脅迫的誘導(dǎo)，推斷該基因可能參與干旱、鹽、高溫和低溫等非生物脅迫的響應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

干旱、鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響作物的生長發(fā)育，是限制作物產(chǎn)量的主要因素之一[19]。 研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育以及逆境脅 迫 下 的 調(diào) 控 表 達(dá) 發(fā) 揮 著 重 要 作 用[4，20～21]，LSD 類鋅指蛋白廣泛參與植物生物及非生物逆境信號傳導(dǎo)過程[22]，其典型的特征是形成鋅指結(jié)構(gòu)并在蛋白質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮作用[23]。 大量研究表明，含有3 個zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因在逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[14～16，24]；ZmLSD1 也含有3 個zf-LSD1 結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其與水稻OsLSD1、玉米ZmLOL1、擬南芥AtLSD1 等蛋白有較高的同源性，屬于典型的鋅指蛋白家族成員。

本研究發(fā)現(xiàn)玉米鋅指蛋白基因ZmLSD1 受植物非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，如干旱、鹽、高溫和低溫等。 在干旱和鹽處理后，ZmLSD1 基因在根、胚芽鞘和葉中的表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢，說明該基因的表達(dá)受干旱和鹽的誘導(dǎo)。 這與香蕉MaZAT10 基因的表達(dá)模式一致，香蕉C2H2 型鋅指蛋白基因MaZAT10 受干旱、鹽和低溫處理的誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá)[25]。 基于溫度(4 ℃、42 ℃)處理的研究發(fā)現(xiàn)，ZmLSD1 基因在胚芽鞘和葉部位的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平受抑制。 該基因?qū)?、熱脅迫的響應(yīng)與苦蕎FtLOL1、水稻OsBBX6 存在一定的相似性，苦蕎鋅指蛋白基因FtLOL1 在4 ℃的低溫脅迫和水楊酸處理下表達(dá)量降低[15]，水稻鋅指蛋白基因OsBBX6 則被發(fā)現(xiàn)負(fù)向響應(yīng)高溫脅迫[26]。ZmLSD1 基因在脫落酸處理下上調(diào)表達(dá)，說明ZmLSD1 基因可能是通過ABA 信號路徑介導(dǎo)植物的逆境響應(yīng)。 而在水楊酸的處理下，ZmLSD1基因在根和葉部位中的表達(dá)量下降。 這與擬南芥鋅指蛋白基因AtLSD1 的表達(dá)趨勢相反，AtLSD1基因通過積極響應(yīng)SA 信號，提升活性氧的清除以降低非生物脅迫的傷害[27]。

玉米鋅指蛋白基因ZmLSD1 對不同的非生物處理表現(xiàn)出不同的表達(dá)特征，可能是該轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合差異或蛋白互作差異產(chǎn)生的結(jié)果，說明ZmLSD1 與玉米逆境響應(yīng)的密切相關(guān)，但其確切的生物學(xué)功能，有待于進(jìn)一步研究。