劉蘭畦,趙燕芳,謝含儀,王珊珊,陳相峰
(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省分析測試中心, 山東 濟南 250014)
中國現(xiàn)階段人口老齡化發(fā)展十分迅速,越來越多的人口步入老年。隨著環(huán)境污染和生活壓力的加劇,老年人肺癌的發(fā)病率不斷增加[1-2]。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快,對人們健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[3-4]。肺癌的治療方法除了傳統(tǒng)的手術(shù),還有化療、靶向治療、免疫治療以及中藥治療等。以靶向治療為例,治療的藥物需要經(jīng)過嚴格的基因檢測,找到合適的突破靶點后才選擇合適的靶向藥物。鹽酸厄洛替尼[5-7]又稱特羅凱,是一種分子靶向治療晚期非小細胞肺癌的藥物,鹽酸厄洛替尼片通過抑制人體細胞內(nèi)表皮生長因子上一種特定酶的活性從而達到抑制腫瘤生長的作用,對提高患者的帶瘤生存率和改善生存質(zhì)量有很好的治療效果[8-11]。但是老年肺癌患者由于臟器功能衰退、代謝功能降低和其他疾病的增多,對藥物伴隨毒副反應耐受性較差,需要對患者所服用的靶向藥物進行基因毒性雜質(zhì)檢測,來避免對服藥患者的二次傷害。基因毒性雜質(zhì)是指能直接或間接損害DNA、引起基因突變或致癌的一類物質(zhì),鹽酸厄洛替尼在生產(chǎn)和儲藏過程中引入的雜質(zhì)存在著一定的毒副反應[12-14],給患者治療造成不良影響,有必要對其加以嚴格控制[15-18]。本文研究并建立了采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺含量的方法,毒理學限值小于10×10-6[19],能夠有效地用于對其中3-乙炔苯胺的質(zhì)量控制。
QTRAP 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Thermo UltiMate 3000液相系統(tǒng)、Thermo Hypersil GOLD C8色譜柱(美國Thermo公司) ;KQ2202 型數(shù)控超聲波清洗機(上海楚柏實驗設(shè)備有限公司);Mettle AB265-S 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。
對照品3-乙炔苯胺純度98%(上海時代生物科技有限公司);甲醇為色譜純(美國天地有限公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);鹽酸厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司)。
色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C8(100 mm×4.6 mm,3 μm),進樣量,5 μL ,柱溫,35 ℃,流速,0.4 mL/min。流動相為甲醇和水,梯度洗脫:0~2 min,20%甲醇;2~6 min,95%甲醇;6~9.5 min,95%甲醇;9.5~12 min,20%甲醇。
采用電噴霧離子源(ESI),多反應監(jiān)測(MRM)模式,正離子檢測,選擇離子對118→75、118→91;離子源噴射電壓5500 V,氣簾氣體(CUR)壓力40 psi(1 psi=6.895 kPa),碰撞氣體(CAD)壓力Medium,溫度600 ℃,霧化氣(GAS1)壓力45 psi,輔助氣(GAS2)壓力50 psi,去簇電壓(DP) 40 eV,碰撞能量(CE) 37 eV。
供試品溶液的制備:取供試品鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,過500目篩,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,即得。
對照品貯備液的制備:取3-乙炔苯胺對照品,精密稱定100.0 mg,置100 mL量瓶中,加入少量甲醇使其溶解,然后用甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成1 mL含1 mg的3-乙炔苯胺的溶液。取上述溶液用甲醇逐級稀釋成濃度為1 mL含100 ng的3-乙炔苯胺溶液,配制100 mL,即得。
對照品溶液的制備:取對照品貯備液5.0 mL,精密量取,置100 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成1 mL含5 ng的溶液,即得。
取甲醇試劑作為空白溶液、供試品溶液質(zhì)譜進樣,證明空白溶液、供試品溶液對被測物測試無干擾;并取供試品含雜質(zhì)的混合溶液進樣。相應的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。結(jié)果表明,空白溶液、供試品中其他雜質(zhì)對目標化合物的檢測無干擾,方法專屬性強。
圖1 對照品溶液、供試品溶液及供試品含雜質(zhì)溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms for the control solution, test solution, and test product solution with the impurity
信噪比(S/N)在3~5的濃度為檢測限濃度,信噪比在10~15的濃度為定量限濃度,計算定量限濃度6針對應的信噪比的相對標準偏差(RSD)應小于等于10.0%。
精密移取對照品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成0.5 ng/mL的溶液,作為檢測限驗證濃度。
精密移取對照品溶液2 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成1 ng/mL的溶液,作為定量限驗證濃度。測試結(jié)果見表1、表2。
表1 檢測限實驗結(jié)果
表2 定量限實驗結(jié)果
結(jié)果顯示:該分析方法中3-乙炔苯胺的檢出限為1.0×10-6;3-乙炔苯胺的定量限為2.0×10-6,其定量限6針信噪比的相對標準偏差為6.08%,且小于10%。
取對照品貯備液適量,分別用甲醇溶液逐級稀釋配制成濃度為1、2、5、6、10、20 ng/mL 的標準溶液,作為線性范圍驗證溶液。取上述溶液各5 μL進樣,記錄色譜圖。
結(jié)果顯示,該分析方法中3-乙炔苯胺在1.0~20.0 ng/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),線性方程為y=23 983.3x-5 594.8,線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 4,呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。
取對照品溶液作為方法精密度測試溶液,連續(xù)重復進樣6次,記錄峰面積響應值,并計算相對標準偏差。結(jié)果顯示該分析方法中3-乙炔苯胺峰面積的相對標準偏差為1.13%,證明方法精密度高。
取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為100% 濃度的測試溶液,作為重復性測試溶液,平行6份,各取5 μL進樣,記錄濃度測定值,并計算相對標準偏差,6份平行樣品待測物實測濃度相對標準偏差為4.74%。結(jié)果顯示,該分析方法中3-乙炔苯胺重復性好。
取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.4 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為80% 濃度的測試溶液,配制3份;取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為100% 濃度的測試溶液,配制3份;取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.6 mL 3-乙炔苯胺對照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標準限度值為120% 濃度的測試溶液,配制3份,作為回收率測試溶液。計算添加3-乙炔苯胺含量的回收率及回收率的相對標準偏差,驗證測定結(jié)果與真實值的差異,來確定該分析方法能否獲得準確的測試結(jié)果。3-乙炔苯胺加標回收測試結(jié)果見表3。
表3 3-乙炔苯胺回收率測試結(jié)果
結(jié)果顯示,該分析方法中3-乙炔苯胺低、中、高的加標的回收率范圍為90.1%~106.1%,回收率相對標準偏差為5.1%,回收率測試結(jié)果良好。
將建立的方法學應用于對鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺的分析。分別取鹽酸厄洛替尼片3個不同批次作為樣品1、樣品2、樣品3,粉碎成粉末,過500目篩,精密稱定5.0 mg,分別置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,超聲2 min后,各取5 μL進樣。測定結(jié)果顯示,樣品1~3均未檢出3-乙炔苯胺。經(jīng)加標回收率實驗,得到樣品中回收率在87.5%~104.5%之間,回收率結(jié)果良好,可見該方法可以應用到實際樣品的分析中。
通過對上述各項指標的驗證,表明采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定鹽酸厄洛替尼中的基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺的分析方法,專屬性強,靈敏度高,回收率好,方法準確、可靠,能夠達到藥物基因毒性雜質(zhì)檢測的技術(shù)要求。