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        鹽酸厄洛替尼基因毒性雜質(zhì)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法學(xué)驗(yàn)證

        2020-05-14 07:57:04劉蘭畦趙燕芳謝含儀王珊珊陳相峰
        山東科學(xué) 2020年2期
        關(guān)鍵詞:量瓶乙炔苯胺

        劉蘭畦,趙燕芳,謝含儀,王珊珊,陳相峰

        (齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省分析測(cè)試中心, 山東 濟(jì)南 250014)

        中國(guó)現(xiàn)階段人口老齡化發(fā)展十分迅速,越來(lái)越多的人口步入老年。隨著環(huán)境污染和生活壓力的加劇,老年人肺癌的發(fā)病率不斷增加[1-2]。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快,對(duì)人們健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[3-4]。肺癌的治療方法除了傳統(tǒng)的手術(shù),還有化療、靶向治療、免疫治療以及中藥治療等。以靶向治療為例,治療的藥物需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的基因檢測(cè),找到合適的突破靶點(diǎn)后才選擇合適的靶向藥物。鹽酸厄洛替尼[5-7]又稱特羅凱,是一種分子靶向治療晚期非小細(xì)胞肺癌的藥物,鹽酸厄洛替尼片通過(guò)抑制人體細(xì)胞內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子上一種特定酶的活性從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,對(duì)提高患者的帶瘤生存率和改善生存質(zhì)量有很好的治療效果[8-11]。但是老年肺癌患者由于臟器功能衰退、代謝功能降低和其他疾病的增多,對(duì)藥物伴隨毒副反應(yīng)耐受性較差,需要對(duì)患者所服用的靶向藥物進(jìn)行基因毒性雜質(zhì)檢測(cè),來(lái)避免對(duì)服藥患者的二次傷害。基因毒性雜質(zhì)是指能直接或間接損害DNA、引起基因突變或致癌的一類物質(zhì),鹽酸厄洛替尼在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過(guò)程中引入的雜質(zhì)存在著一定的毒副反應(yīng)[12-14],給患者治療造成不良影響,有必要對(duì)其加以嚴(yán)格控制[15-18]。本文研究并建立了采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺含量的方法,毒理學(xué)限值小于10×10-6[19],能夠有效地用于對(duì)其中3-乙炔苯胺的質(zhì)量控制。

        1 儀器與材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

        QTRAP 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Thermo UltiMate 3000液相系統(tǒng)、Thermo Hypersil GOLD C8色譜柱(美國(guó)Thermo公司) ;KQ2202 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(上海楚柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Mettle AB265-S 型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)材料

        對(duì)照品3-乙炔苯胺純度98%(上海時(shí)代生物科技有限公司);甲醇為色譜純(美國(guó)天地有限公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);鹽酸厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 色譜條件

        色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C8(100 mm×4.6 mm,3 μm),進(jìn)樣量,5 μL ,柱溫,35 ℃,流速,0.4 mL/min。流動(dòng)相為甲醇和水,梯度洗脫:0~2 min,20%甲醇;2~6 min,95%甲醇;6~9.5 min,95%甲醇;9.5~12 min,20%甲醇。

        2.2 質(zhì)譜條件

        采用電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,正離子檢測(cè),選擇離子對(duì)118→75、118→91;離子源噴射電壓5500 V,氣簾氣體(CUR)壓力40 psi(1 psi=6.895 kPa),碰撞氣體(CAD)壓力Medium,溫度600 ℃,霧化氣(GAS1)壓力45 psi,輔助氣(GAS2)壓力50 psi,去簇電壓(DP) 40 eV,碰撞能量(CE) 37 eV。

        2.3 溶液的制備

        供試品溶液的制備:取供試品鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,過(guò)500目篩,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,即得。

        對(duì)照品貯備液的制備:取3-乙炔苯胺對(duì)照品,精密稱定100.0 mg,置100 mL量瓶中,加入少量甲醇使其溶解,然后用甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成1 mL含1 mg的3-乙炔苯胺的溶液。取上述溶液用甲醇逐級(jí)稀釋成濃度為1 mL含100 ng的3-乙炔苯胺溶液,配制100 mL,即得。

        對(duì)照品溶液的制備:取對(duì)照品貯備液5.0 mL,精密量取,置100 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成1 mL含5 ng的溶液,即得。

        3 分析方法驗(yàn)證

        3.1 專屬性驗(yàn)證

        取甲醇試劑作為空白溶液、供試品溶液質(zhì)譜進(jìn)樣,證明空白溶液、供試品溶液對(duì)被測(cè)物測(cè)試無(wú)干擾;并取供試品含雜質(zhì)的混合溶液進(jìn)樣。相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見圖1。結(jié)果表明,空白溶液、供試品中其他雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)無(wú)干擾,方法專屬性強(qiáng)。

        圖1 對(duì)照品溶液、供試品溶液及供試品含雜質(zhì)溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms for the control solution, test solution, and test product solution with the impurity

        3.2 定量限及檢測(cè)限驗(yàn)證

        信噪比(S/N)在3~5的濃度為檢測(cè)限濃度,信噪比在10~15的濃度為定量限濃度,計(jì)算定量限濃度6針對(duì)應(yīng)的信噪比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于等于10.0%。

        精密移取對(duì)照品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成0.5 ng/mL的溶液,作為檢測(cè)限驗(yàn)證濃度。

        精密移取對(duì)照品溶液2 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成1 ng/mL的溶液,作為定量限驗(yàn)證濃度。測(cè)試結(jié)果見表1、表2。

        表1 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        表2 定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        結(jié)果顯示:該分析方法中3-乙炔苯胺的檢出限為1.0×10-6;3-乙炔苯胺的定量限為2.0×10-6,其定量限6針信噪比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.08%,且小于10%。

        3.3 線性范圍驗(yàn)證

        取對(duì)照品貯備液適量,分別用甲醇溶液逐級(jí)稀釋配制成濃度為1、2、5、6、10、20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為線性范圍驗(yàn)證溶液。取上述溶液各5 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。

        結(jié)果顯示,該分析方法中3-乙炔苯胺在1.0~20.0 ng/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),線性方程為y=23 983.3x-5 594.8,線性相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 4,呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

        3.4 方法精密度驗(yàn)證

        取對(duì)照品溶液作為方法精密度測(cè)試溶液,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積響應(yīng)值,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示該分析方法中3-乙炔苯胺峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%,證明方法精密度高。

        3.5 重復(fù)性驗(yàn)證

        取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為100% 濃度的測(cè)試溶液,作為重復(fù)性測(cè)試溶液,平行6份,各取5 μL進(jìn)樣,記錄濃度測(cè)定值,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,6份平行樣品待測(cè)物實(shí)測(cè)濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.74%。結(jié)果顯示,該分析方法中3-乙炔苯胺重復(fù)性好。

        3.6 加標(biāo)回收率驗(yàn)證

        取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.4 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為80% 濃度的測(cè)試溶液,配制3份;取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.5 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為100% 濃度的測(cè)試溶液,配制3份;取鹽酸厄洛替尼片,粉碎成粉末,精密稱定5.0 mg,置10 mL量瓶中,再精確加入0.6 mL 3-乙炔苯胺對(duì)照品貯備溶液,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2 min,配制成含3-乙炔苯胺標(biāo)準(zhǔn)限度值為120% 濃度的測(cè)試溶液,配制3份,作為回收率測(cè)試溶液。計(jì)算添加3-乙炔苯胺含量的回收率及回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值的差異,來(lái)確定該分析方法能否獲得準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果。3-乙炔苯胺加標(biāo)回收測(cè)試結(jié)果見表3。

        表3 3-乙炔苯胺回收率測(cè)試結(jié)果

        結(jié)果顯示,該分析方法中3-乙炔苯胺低、中、高的加標(biāo)的回收率范圍為90.1%~106.1%,回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%,回收率測(cè)試結(jié)果良好。

        3.7 樣品含量測(cè)定

        將建立的方法學(xué)應(yīng)用于對(duì)鹽酸厄洛替尼片中基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺的分析。分別取鹽酸厄洛替尼片3個(gè)不同批次作為樣品1、樣品2、樣品3,粉碎成粉末,過(guò)500目篩,精密稱定5.0 mg,分別置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,超聲2 min后,各取5 μL進(jìn)樣。測(cè)定結(jié)果顯示,樣品1~3均未檢出3-乙炔苯胺。經(jīng)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),得到樣品中回收率在87.5%~104.5%之間,回收率結(jié)果良好,可見該方法可以應(yīng)用到實(shí)際樣品的分析中。

        4 結(jié)論

        通過(guò)對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)的驗(yàn)證,表明采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定鹽酸厄洛替尼中的基因毒性雜質(zhì)3-乙炔苯胺的分析方法,專屬性強(qiáng),靈敏度高,回收率好,方法準(zhǔn)確、可靠,能夠達(dá)到藥物基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)的技術(shù)要求。

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