盧婉 劉艷秋 黃寧 周吉會 饒慧華 黎俏 吳翠婷 周萍

閉經(jīng)是婦科常見的癥狀，可因生殖器發(fā)育不全、下丘腦-垂體功能異常、藥物、遺傳等不同的原因引起，通常將閉經(jīng)分為原發(fā)性閉經(jīng)和繼發(fā)性閉經(jīng)。原發(fā)性閉經(jīng)是指女性年齡超過14周歲仍無第二性征發(fā)育，或者年齡超過16周歲出現(xiàn)第二性征發(fā)育但無月經(jīng)來潮[1]。導致原發(fā)性閉經(jīng)的原因很多，其中染色體異常是引起原發(fā)性閉經(jīng)的重要遺傳因素，且不能治愈，因此若能早發(fā)現(xiàn)早診斷，并通過合理的治療改善患者的性器官發(fā)育，對減少患者身心傷害及提高生活質量具有明顯的幫助[2-3]。本文對122例原發(fā)性閉經(jīng)患者進行外周血染色體核型分析，并且對涉及Y染色體的患者利用PCR熒光探針法進行Y染色體微缺失檢測，以探討原發(fā)性閉經(jīng)與染色體異常及Y染色體微缺失的關系。

對象與方法

1. 研究對象：選擇2015年1月至2017年12月于江西省婦幼保健院就診的122例原發(fā)性閉經(jīng)者，社會性別為女性，平均年齡14～31歲。每位患者詳細記錄病史，抽取外周血。

2.納入標準：原發(fā)性閉經(jīng)的診斷標準為：年齡超過14歲，第二性征未發(fā)育；或者年齡超過16歲，第二性征已發(fā)育但月經(jīng)還未來潮。因化學因素、放射因素、免疫因素或醫(yī)源性損傷等引起的閉經(jīng)患者均排除在外。納入的患者均簽署知情同意書。

3.研究方法

(1)外周血染色體核型分析：抽取患者外周血2 ml，使用肝素抗凝。用7號針頭接種28滴(約1 mL)全血于淋巴細胞培養(yǎng)液中(達輝生物技術公司)，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)終止前4 h加入秋水仙素(20 μg/mL)，按常規(guī)方法制片，G顯帶，分辨率為320～400條帶。使用萊卡染色體核型掃描分析系統(tǒng)，計數(shù)30個核型，至少分析5個核型，嵌合體病例計數(shù)至少50個核型。按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2013)的標準命名核型。

(2) 全血基因組DNA提?。簢栏癜凑赵噭┖姓f明操作，靜脈抽取患者2 mL的EDTA抗凝外周血，混勻后取200 μL全血，采用自動化儀器(天隆NP968磁珠核酸提取儀)抽提DNA。

(3)PCR擴增及熒光信號定量分析：采用兩管多重PCR擴增，四個通道(FCMVIC/ROX/Cy5)熒光檢測的方法，判斷AZFa (sY84,sY86)，AZFb (sY127,sY134)，AZFc (sY254,sY255) 三個區(qū)域六個序列標簽位點(STS)的微缺失，同時設置兩個內(nèi)對照基因：男性性別決定基因(SRY)和編碼鋅指蛋白基因ZFX/ZFY。

結果

1.外周血染色體核型及臨床表現(xiàn)

122例原發(fā)性閉經(jīng)患者中共檢出異常核型30例，異常率為24.6%。其中性染色體數(shù)目異常10例，性染色體結構異常10例，性染色體數(shù)目及結構異常1例，性染色體與常染色體平衡易位1例，性分化異常6例，常染色體異常2例。30例異常核型中涉及性染色體的有28例，占93.3%(表1)。性染色體核型的異常，常導致其生長發(fā)育異常，且不同的性染色體異常核型，其臨床表現(xiàn)也有差異之分，主要表現(xiàn)為特納綜合征、超雌綜合癥、生殖發(fā)育異常等(表2)。

2.Y染色體微缺失檢測

對6例涉及Y染色體的患者進一步檢測Y染色體微缺失，發(fā)現(xiàn)4例46,XY患者及1例45,X[22]/46,X,dic(Y)[28]嵌合體患者存在SRY基因；1例核型為46,X,+mar[76]/45,X[20]/46,XY[4]的患者有SRY基因，但是Y染色體存在AZFc區(qū)域缺失。

討論

閉經(jīng)是婦科常見的癥狀之一，根據(jù)病因的不同可分為原發(fā)性閉經(jīng)和繼發(fā)性閉經(jīng)。染色體異常是原發(fā)性閉經(jīng)重要因素之一，其異常率可達23%～45%[4-6]。在本研究的122例原發(fā)性閉經(jīng)患者中，共檢查30例染色體異常，異常率為24.6%，與國內(nèi)其他文獻報道接近。在30例染色體異?；颊咧?，性染色體異常有28例，占93.3%，提示性染色體異常是導致原發(fā)性閉經(jīng)的重要原因之一[3]。其中包括性染色體數(shù)目異常10例，性染色體結構異常10例，性染色體數(shù)目及結構異常1例，性染色體與常染色體平衡易位1例及性分化異常6例。

性染色體數(shù)目異常中45,X是最常見的核型，有5例，占16.7%，這也是先天性卵巢發(fā)育不全(Turner綜合征)常見的異常核型[7]。由于缺乏一條X染色體，患者表現(xiàn)為智力一般、身材矮小、蹼頸、肘關節(jié)外翻、幼稚型生殖器。此外，3例45,X/46,XX嵌合體患者則根據(jù)嵌合比例的不同表現(xiàn)出輕重不一的癥狀。2例47,XXX(超雌綜合癥)患者，表現(xiàn)為身材矮小、肥胖、短頸、骨骼發(fā)育異常[8]。

性染色體結構異常主要包括X染色體長臂等臂、長臂缺失、短臂缺失、假雙著絲粒等，占33.3%。不平衡的染色體結構異常通常會造成卵巢發(fā)育不全，導致閉經(jīng)[9]。本研究中10例患者主要表現(xiàn)為智力稍差、乳房未發(fā)育、無陰毛、外陰幼女型、幼稚子宮、卵巢發(fā)育不良、未見卵泡。另外還有1例性染色體-常染色體平衡易位，可能由于平衡易位造成基因結構或功能的破壞而致卵巢發(fā)育不良，引起閉經(jīng)。

表1 30例異常染色體核型分析

表2 部分染色體異常核型患者的臨床表現(xiàn)

Y染色體的95%是男性特異性的區(qū)域，包含性別特異性的胚胎發(fā)育的遺傳物質，如睪丸決定基因(sex determining region Y,SRY)以及控制精子發(fā)生的基因無精癥因子(azoospermia factor,AZF)。AZF基因影響著精子的生成，發(fā)生AZF基因的缺失稱為AZF微缺失，也稱Y染色體微缺失[10-11]。本組4例核型為46,XY的患者生物學性別為男性，稱為性反轉綜合癥，兒童期臨床表現(xiàn)為兩性畸形、性腺發(fā)育不良、身材矮小，成人表現(xiàn)為閉經(jīng)以及不孕癥。對這4例性反轉患者和1例45,X[22]/46,X,dic(Y)[28]嵌合體患者進行AZF基因檢測，發(fā)現(xiàn)SRY均為陽性。而核型為46,X,+mar[76]/45,X[20]/46,XY[4]的患者雖有SRY基因，但是Y染色體存在AZFc區(qū)域缺失，臨床表現(xiàn)為無子宮卵巢、性腺條索狀。

本研究中，除去30例檢測染色體異常的患者，仍有92例患者為正常核型46,XX，但由于其卵巢衰竭或性腺功能障礙，在臨床上表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)。雖然這部分患者為正常核型，但鑒于目前染色體核型分析技術分辨率有限，尚無法有效檢出小于5Mb的結構異常和變異，存在染色體微小缺失的漏檢[12]。此外，國外有研究者利用基因組雜交技術對染色體核型正常但卵巢早衰的患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)部分患者存在染色體微缺失[13]。由此可見，對于染色體核型正常的原發(fā)性閉經(jīng)患者，進一步的基因檢測以排除染色體微缺失的可能性是十分有必要的。

綜上所述，引起原發(fā)性閉經(jīng)的重要原因之一為性染色體異常，對閉經(jīng)的患者尤其是伴有性腺、生殖器異常的患者進行核型分析，對患者早診斷早治療有很好的臨床意義。