李云秀 李杉 程叢叢 武金玉 袁海濤 尤琪

卵巢腫瘤是婦科癌癥病人死亡的主要原因之一，其中以漿液性腫瘤最為常見。由于卵巢位于盆腔深部，故通常發(fā)病較隱匿，加上缺乏普查、診斷、治療的有效措施，且早期檢測策略缺乏特異性和敏感性，導(dǎo)致75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期致命的階段。因此，對(duì)其機(jī)制的研究及檢測卵巢腫瘤的可靠生物標(biāo)志物的設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)一直是婦科腫瘤醫(yī)師研究的熱點(diǎn)。只有對(duì)其發(fā)生機(jī)制有較深刻的理解，才能更好地指導(dǎo)臨床治療[1-3]。有研究者認(rèn)為，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與卵巢上皮性癌關(guān)系密切[4]。本研究主要應(yīng)用免疫組化法(SP法)檢測Wnt/β-catenin 信號(hào)通路成分GSK-3β、c-myc在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)情況，探討Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在卵巢漿液性腫瘤發(fā)病的作用機(jī)制，為卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料：收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2016年09月—2018年11月110例病理科保存的人卵巢組織標(biāo)本蠟塊(包括正常卵巢上皮組織26例、良性漿液性囊腺瘤24例及漿液性癌60例)。所有標(biāo)本經(jīng)兩位病理醫(yī)師重新復(fù)檢，再次確認(rèn)病理組織學(xué)分型及分級(jí)。本研究在取樣本前充分告知患者標(biāo)本用途，并取得患者同意，且經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2. 方法：采用免疫組化法(SP法)。所有標(biāo)本4μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，檸檬酸鹽修復(fù)抗原，加入一抗(兔抗人GSK-3β單克隆抗體，工作濃度1∶50；鼠抗人c-myc單克隆抗體，工作濃度為1∶50，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，4℃過夜，PBS沖洗3次，加入二抗(多聚物酶標(biāo)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，20 min后PBS沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精襯染，脫水、透明、封固，顯微鏡觀察并攝片。

3. 結(jié)果判定：GSK-3β在細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性染色，c-myc在胞核呈棕黃色顆粒為陽性染色，每張切片至少隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:

(1)根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例評(píng)分。染色細(xì)胞數(shù)0%～5%為0分，染色細(xì)胞數(shù)在6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；

(2)根據(jù)染色細(xì)胞的染色強(qiáng)度評(píng)分。未見出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為0分，(弱)淡黃色為1分，(中)棕黃色為2分，(強(qiáng))棕褐色為3分；

(3)前兩者乘積0～2分為(-)，3～5 分為(+)，6～8分為(++)，≥9 分為(+++)。

綜合評(píng)分結(jié)果：≥3分作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行表達(dá)差異分析，采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.GSK-3β在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)：GSK-3β在細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽性染色(見圖1),在正常卵巢組織、良性漿液性囊腺瘤及漿液性腺癌中的表達(dá)陽性率逐漸增高，分別為26.9%、66.7%及71.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)；GSK-3β在卵巢漿液性癌組織的高級(jí)別組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、FIGO分期III+IV期的表達(dá)陽性率明顯高于低級(jí)別組、無淋巴轉(zhuǎn)移組、I+II期(P均<0.05，見表2)。

2.c-myc在卵巢漿液性腫瘤中的表達(dá)：c-myc在胞核呈棕黃色顆粒為陽性染色(見圖2)，在卵巢漿液性腺癌中的表達(dá)陽性率明顯高于卵巢正常組織及良性漿液性囊腺瘤,表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。c-myc在卵巢漿液性癌高級(jí)別組(81.0%)的表達(dá)高于低級(jí)別組(22.2%)，提示其與卵巢漿液性癌的病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05見表2)，III+IV期卵巢漿液性癌組織中c-myc的表達(dá)(65.5%)高于I+II期(61.3%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)，提示c-myc的表達(dá)與FIGO分期無關(guān)；c-myc在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)無明顯差異。

表1 GSK-3β、c-myc在卵巢正常組織、良性漿液性囊腺瘤和漿液性癌三組中的表達(dá)

注：*P<0.05

表2 GSK-3β、c-myc在卵巢漿液性癌組織中與臨床參數(shù)的比較

注：GSK-3β在兩組的表達(dá)比較，*P<0.05； c-myc在兩組的表達(dá)比較，#P<0.05

3. 卵巢漿液性癌中GSK-3β與c-myc表達(dá)的相關(guān)性：卵巢漿液性癌中GSK-3β的陽性率為71.7%(43/60)，c-myc的陽性率為63.3%(38/60)，共同的陽性率為56.7%(34/60)，共同的陰性率為21.7%(13/60)。相關(guān)性分析顯示，兩者在卵巢癌中的表達(dá)呈現(xiàn)出正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路也稱作經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，是高等動(dòng)物胚胎組織發(fā)育分化所必需的關(guān)鍵信號(hào)通路，主要參與細(xì)胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等，是涉及癌癥侵襲轉(zhuǎn)移過程的信號(hào)通路，Wnt/β-catenin信號(hào)通路已發(fā)現(xiàn)在很多癌癥中都有激活，包括卵巢癌[5]。

GSK-3β是一種高度保守絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是糖原合成酶激酶的限速酶。有研究表明[6]，GSK-3β過度表達(dá)或異常激酶活性可以增加細(xì)胞增殖和活力，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。當(dāng)各種致癌因素導(dǎo)致經(jīng)典Wnt通路中的相關(guān)靶基因異常表達(dá)時(shí)，Wnt信號(hào)通路被異常激活，Wnt信號(hào)通過與特異性膜受體FZD結(jié)合傳導(dǎo)信號(hào)，GSK-3β的活性異常，使β-catenin降解過程受阻而在胞漿內(nèi)大量積聚，達(dá)到一定水平時(shí)就可以轉(zhuǎn)入核內(nèi)通過與TCF/LEF相互作用促進(jìn)下游靶基因(c-myc、cyclinD1、MMP-7等)轉(zhuǎn)錄，使原癌基因或細(xì)胞調(diào)控因子基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞性質(zhì)變化、細(xì)胞周期失控，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性增殖，最終引起腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展。β-catenin 在細(xì)胞核中也可以直接與GSK-3β結(jié)合，降低β-catenin/TCF依賴的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞增殖。除β-catenin 外，GSK-3β還可以調(diào)節(jié)Axin的穩(wěn)定性和APC連接β-catenin 的效率，引發(fā)細(xì)胞周期的失控，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲。 Georgievska[7]等報(bào)道稱GSK-3β抑制劑可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白抑制細(xì)胞增殖。有研究[8-11]表明，GSK-3β的“過度激活”可能作用于幾種人類癌癥中的癌基因，包括結(jié)腸癌，口腔癌，骨肉瘤，惡性黑色素瘤等。GSK-3β抑制劑已被證明可抑制胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、白血病中惡性細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：GSK-3β在癌組織的表達(dá)明顯高于正常組織及腺瘤組織，在癌組織中的比較發(fā)現(xiàn)，在高級(jí)別、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及FIGO分期高的病例中GSK-3β高表達(dá)。因此，GSK-3β可以作為一個(gè)理論點(diǎn)進(jìn)行深入研究，以提高臨床對(duì)卵巢漿液性腫瘤的認(rèn)識(shí)。

原癌基因c-myc是 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中非常重要的靶基因,是細(xì)胞周期調(diào)控因子中的一員，多種腫瘤中c-myc 高表達(dá)與β-catenin 異常表達(dá)和Wnt突變有關(guān)[12]。c-myc由β-catenin/TCF-4激活轉(zhuǎn)錄，可促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，也可激活細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞從G0期→G1期的過程中起重要作用，進(jìn)而引起細(xì)胞性質(zhì)的變化，刺激胚胎發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞生長，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。同時(shí)，c-myc基因也具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，可以協(xié)同Her-2基因激活細(xì)胞增殖信號(hào)，促進(jìn)惡性腫瘤的生長。c-myc還可通過改變細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞粘附，侵襲性和血管生成能力來調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)和支持細(xì)胞增殖的能力，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，c-myc在卵巢漿液性癌中高表達(dá)，與Ning[13]等研究結(jié)果一致。高級(jí)別組c-myc的表達(dá)率明顯高于低級(jí)別組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示c-myc的表達(dá)與卵巢漿液性腫瘤病理分級(jí)有關(guān)；III-IV期卵巢漿液性癌組織中c-myc的表達(dá)高于I-II期，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示c-myc的表達(dá)與FIGO分期無關(guān)。c-myc在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中也無明顯差異。因此，c-myc在促進(jìn)卵巢細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的過程中，可能與細(xì)胞分化有關(guān)，但可能不參與卵巢癌的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

GSK-3β與c-myc表達(dá)之間存在正相關(guān)，且均在卵巢癌中高表達(dá)，表明GSK-3β和c-myc可能在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中起著一定的協(xié)同作用，且二者對(duì)腫瘤的發(fā)展均存在正調(diào)節(jié)作用，二者的高表達(dá)均能夠持續(xù)Wnt信號(hào)通路，從而激活一系列靶基因引起細(xì)胞的持續(xù)增殖及惡性進(jìn)展，但兩者之間是否存在協(xié)同調(diào)節(jié)作用需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上所述，Wnt信號(hào)通路本身是一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，Wnt信號(hào)通路的異常激活可引起細(xì)胞異常增殖、分化而導(dǎo)致腫瘤。本研究證實(shí)，GSK-3β、c-myc在卵巢漿液性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，因此，GSK-3β、c-myc有望成為卵巢漿液性腫瘤早期診斷、早期治療的分子標(biāo)志物。通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的某些關(guān)鍵因子或應(yīng)用Wnt拮抗劑可阻斷信號(hào)通路的異常激活，從而抑制腫瘤的發(fā)生，有望成為卵巢漿液性腫瘤的治療新靶點(diǎn)。但具體的作用機(jī)制及靶點(diǎn)間的相互作用還需要進(jìn)一步研究。

圖1 GSK-3β在卵巢正常組織(A)、良性漿液性囊腺瘤(B)、漿液性癌(C)中的表達(dá)(SP,×200)

圖2 c-myc在卵巢正常組織(A)、良性漿液性囊腺瘤(B)、漿液性癌(C)中的表達(dá)(SP,×200)