王麗麗 趙敏

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA) 是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，大多數(shù)為早期流產(chǎn)，少數(shù)為晚期流產(chǎn)，發(fā)病率約1%～5%[1]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致不孕不育[2]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因包括胚胎染色體異常、免疫功能異常、內(nèi)分泌功能異常、子宮解剖異常等[3]。越來越多的研究表明不明原因的自然流產(chǎn)與免疫因素相關(guān)[4-5]。胚胎作為同種異體移植物不被母體免疫排斥是免疫學(xué)原理的例外；而妊娠的成功與否，取決于母體與胚胎或胎兒之間的免疫調(diào)節(jié)[6]。Thl型細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 等，可以促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，也參與了自身免疫疾病發(fā)病過程[7]。在妊娠過程中，Th1細(xì)胞影響胚胎著床及發(fā)育，Th1型細(xì)胞因子占優(yōu)勢會引起妊娠丟失[8]。Th2型細(xì)胞則分泌白介素-10 (IL-10)等，可以促進(jìn)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，另一方面也參與自身免疫疾病的發(fā)病過程，Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢有利于母胎免疫耐受的產(chǎn)生和妊娠的維持。細(xì)胞因子維持胎兒和母體免疫系統(tǒng)之間的平衡，一旦這種動態(tài)平衡被打破，母體內(nèi)的免疫系統(tǒng)對胚胎或胎兒的排斥反應(yīng)由原來的抑制轉(zhuǎn)變?yōu)樵鰪?qiáng)，就會引起病理性妊娠，嚴(yán)重者則會發(fā)生RSA[9]。本課題通過測定RSA組和對照組中絨毛及蛻膜組織中腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白-2(TIPE2)、TNF-α、IL-10的表達(dá)變化，旨在研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中TIPE2通過對Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的影響，參與RSA的發(fā)生與發(fā)展。

對象與方法

1. 研究對象：選取2017年9月—2018年8月山西省婦幼保健院婦科收治的RSA患者30例(RSA組)，選擇同期就診要求終止妊娠的正常早孕患者、既往無不良孕史、本次妊娠無先兆流產(chǎn)征兆33例(對照組)。兩組患者均無染色體異常、生殖道異常；近3個月內(nèi)沒有自身免疫疾病、內(nèi)分泌疾病、生殖器感染和激素治療，兩組患者均以人工流產(chǎn)術(shù)終止妊娠。兩組研究對象年齡22～35歲，孕齡6～12周。在年齡及終止妊娠孕周數(shù)上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究通過山西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，標(biāo)本的收集均經(jīng)本人及家屬知情同意并簽字。

表1 RSA組和對照組孕婦基本資料的比較

注：與對照組比較，*P>0.05

2. 試劑和儀器：TIPE2購自武漢三鷹公司；TNF-α、IL-10均購自北京博奧森公司；二抗試劑盒、DAB顯色均購自博士德公司；粘附載玻片購自世泰公司。

3.樣本收集和處理：收集人工流產(chǎn)后絨毛和蛻膜組織，生理鹽水洗滌樣本，至無明顯肉眼可見殘留血液，立即置10%的中性甲醛溶液中固定，乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。

4.檢測方法：采用免疫組織化學(xué)SP法檢測兩組患者絨毛和蛻膜組織中的TNF-α、TIPE2、IL-10表達(dá)。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作陰性對照，按試劑盒說明書操作。由兩位病理科醫(yī)師據(jù)盲法閱片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：鏡下陽性細(xì)胞包質(zhì)呈棕黃色，高倍鏡下可見棕黃色顆粒。隨機(jī)觀察5張100倍視野，并且所有圖片均在同一光學(xué)條件下拍攝，采用顯色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分率法相結(jié)合判讀結(jié)果。按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占百分比計分：細(xì)胞無色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、>50%為3分；上述兩分值相乘，乘積等于0判為陰性、1～3為弱陽性(+) 、4～5為中度陽性(++) 、≥6為強(qiáng)陽性(+++) ，+ 、++ 、+++均為陽性。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.RSA組和對照組絨毛中IL-10、TNF-α、TIPE2表達(dá)的比較:RSA組絨毛中IL-10、TIPE2陽性例數(shù)低于對照組，TNF-α陽性例數(shù)高于對照組，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2. RSA組和對照組蛻膜中IL-10、TNF-α、TIPE2表達(dá)的比較：RSA組蛻膜中IL-10、TIPE2的陽性例數(shù)低于對照組，TNF-α的陽性例數(shù)高于對照組，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3. RSA組絨毛及蛻膜組織中IL-10、TNF-α、TIPE2陽性表達(dá)相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)分析顯示RSA組中IL-10、TNF-α和TIPE2在絨膜和蛻膜的表達(dá)呈正相關(guān)，且有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05，見表4。

討論

正常胚胎不被母體排斥依賴于母-胎界面的免疫耐受,一旦這種免疫耐受被打破,將導(dǎo)致RSA[10]。正常情況下Th1/Th2型免疫反應(yīng)維持在平衡狀態(tài)，但是這種平衡是一種負(fù)反饋的動態(tài)平衡[11-13]。在胚胎植入時及以后的妊娠過程中，母-胎界面的細(xì)胞因子以Th2型為主，使Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)激活NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴的應(yīng)答抑制，防止對滋養(yǎng)細(xì)胞和胎兒的繼發(fā)損傷，使妊娠得以成功進(jìn)行。Th1型細(xì)胞因子對著床、滋養(yǎng)細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育和胎兒生存是有害的；當(dāng)Th1/Th2型免疫反應(yīng)平衡偏向Th1時，則可能影響胚胎及胎兒的生長發(fā)育，嚴(yán)重時可導(dǎo)致免疫型流產(chǎn)[14-15]。李昭榮等[16]的研究表明，RSA患者蛻膜組織中Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)水平均高于正常妊娠組，而Th2型細(xì)胞因子的水平卻顯著低于正常妊娠組，呂興鈺等[17]的研究結(jié)果提示，RSA患者絨毛與蛻膜中TNF-α的水平顯著高于對照組，而IL-10的表達(dá)水平顯著低于對照組。本研究結(jié)果顯示：RSA組絨毛及蛻膜組織中TNF-α明顯高于對照組、IL-10明顯低于對照組，這與以往報道一致。

TIPE2是2002年發(fā)現(xiàn)的一免疫負(fù)調(diào)控分子，在炎癥和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。TIPE2參與了較多疾病的發(fā)生與發(fā)展，Zhang L[18]等報道了TIPE2蛋白在結(jié)腸、闌尾、腺上皮細(xì)胞、食管、宮頸分層鱗狀上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中的高度表達(dá)。TIPE2在兒童哮喘[19]和慢性乙肝病人中外周血的表達(dá)量是降低的，TIPE2在感染引起的胞吞作用和氧化應(yīng)激中均發(fā)揮重要的抑制作用，同時還參與了慢性阻塞性肺疾病[20]、慢加急性肝衰竭[21]、潰瘍性結(jié)腸炎[22]等疾病過程，因此TIPE2的免疫負(fù)調(diào)控功能已被大家廣泛認(rèn)同。但是，TIPE2在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的機(jī)制國內(nèi)外文獻(xiàn)少有報道。本研究結(jié)果顯示RSA患者絨毛及蛻膜組織中TIPE2、IL-10的表達(dá)均低于對照組，TNF-α表達(dá)高于對照組，IL-10、TNF-α、TIPE2在RSA組絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)均呈正相關(guān)，提示IL-10、TNF-α、TIPE2復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中均發(fā)生了改變。

表2 RSA組和對照組絨毛中IL-10、TNF-α、TIPE2表達(dá)的比較

注：和對照組比較，*P<0.05

表3 RSA組和對照組蛻膜中IL-10、TNF-α、TIPE2表達(dá)的比較

注：和對照組比較，*P<0.05

表4 RSA組絨毛及蛻膜組織中IL-10、TNF-α、TIPE2陽性表達(dá)相關(guān)性分析

注：*P<0.05

總之，母體與胎兒間的協(xié)調(diào)共存是妊娠成功的關(guān)鍵[23-24]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明母胎界面免疫的失衡與RSA發(fā)生密切相關(guān)，隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，RSA的發(fā)病機(jī)制將得到進(jìn)一步闡明，為病理妊娠的預(yù)防和治療，改善母兒預(yù)后必將有突破性進(jìn)展。