蘇小紅， 范 超， 王 欣， 孫 麗， 周 闖， 王玉鵬， 湯曉玉， 劉 偉

(1.黑龍江省能源環(huán)境研究院, 哈爾濱 150022; 2.農業(yè)部農村可再生能源開發(fā)重點實驗室， 成都 610041)

中國是傳統(tǒng)的農業(yè)生產大國，各類農作物秸稈資源豐富、分布廣泛。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國的農作物秸稈年產量已達8億t左右，尤其我國東北地區(qū)秸稈資源量巨大，約占全國產量的1/4。目前，中國大部分地區(qū)對農作物秸稈常見的處理方式為：直接還田、隨意堆棄、就地焚燒、或與畜禽糞便漚肥等。但無論是直接還田，還是隨意堆棄、就地焚燒，這些不合理的做法不僅造成土壤板結、肥力下降、生態(tài)環(huán)境遭到破壞、出苗率低，還會影響道路通行、環(huán)境美觀、造成生物質能源及熱量資源的浪費和大氣環(huán)境的污染[1-5]。

將農業(yè)生產過程產生的秸稈通過厭氧發(fā)酵技術轉化為綠色能源沼氣，就能變廢為寶，是合理利用農業(yè)廢棄物的重要途徑，也是中國目前大力倡導發(fā)展的技術之一[6-8]。農業(yè)廢棄物中的秸稈主要成分為:木質纖維素類物質，纖維素、半纖維素和木質素，而秸稈中的木質素是高分子聚合物，不能被微生物轉化分解的，并將纖維素和半纖維素包裹于其中，且在纖維素、半纖維素和木質素分子之間存在著不同的結合力[9,10]，使其難以被微生物直接降解利用，當通過厭氧發(fā)酵技術進行生物轉化過程中，水解酸化緩慢、產氣周期長、秸稈利用效率低，因此限制了秸稈的能源化利用，所以采用適合的預處理技術很有必要[11]。預處理是植物纖維原料進行生物轉化的第一步。預處理的目的是改變天然纖維素的結構，破壞纖錐素-木質素-半纖維素之間的連接[12]，降低纖維素的結晶度，脫去木質素，增加原料的疏松性以增加纖維素酶系與纖維素的有效接觸，從而提高酶解效率[13-14]。

目前，常用預處理方法有物理法、化學法、生物法，如汽爆、酸解、氨解、酶水解等，這些方法具有預處理量小、能耗高、污染環(huán)境等特點不適用于大型秸稈沼氣工程原料前處理上。而我國東北寒區(qū)收獲后的秸稈發(fā)干黃化，且具有收獲的季節(jié)性和使用的局限性特點，而秸稈沼氣工程要求原料的全年持續(xù)供應，所以尋找一種處理量大經(jīng)濟高效的預處理方法尤為必要。黃貯法最初是應用于秸稈飼料領域，黃貯使得干玉米秸稈變得濕潤、結構疏松、易消化，且黃貯法具有易操作、易儲藏、無污染，處理量大等優(yōu)點，理論上適用于寒區(qū)大型連續(xù)秸稈沼氣工程原料預處理。

本項目選用黃貯飼料法對秸稈進行預處理后再進行厭氧發(fā)酵產甲烷試驗，破壞秸稈木質纖維素結構，增加微生物可生化面積，增加還原性糖的含量，提高秸稈產氣效果[15-17]，所以本研究分析預處理后及發(fā)酵過程中秸稈組分變化，為秸稈發(fā)酵過程中動態(tài)變化分析提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用黃貯預處理后的秸稈作為厭氧發(fā)酵原料；選擇黑龍江省能源環(huán)境研究院中試平臺厭氧發(fā)酵罐中的發(fā)酵后的沼液作為微生物接種劑。

1.2 試驗設計

1.2.1 黃貯試驗設計

黃貯試驗選用粉碎成1～3 cm的自然風干玉米秸稈作為試驗原料，采用2 L燒杯作為黃貯容器，將粉碎后的秸稈按70%含水率逐層添加至燒杯中，邊噴水邊壓實，填滿后用塑料覆蓋并用繩勒緊密封，黃貯90 d。

1.2.2 厭氧發(fā)酵試驗設計

黃貯預處理后的玉米秸稈通過厭氧發(fā)酵裝置進行厭氧發(fā)酵產甲烷試驗，發(fā)酵裝置采用沼氣潛力分析儀(BMP)，發(fā)酵單元采用500 mL廣口瓶，有效容積400 mL，采用本團隊研發(fā)的高溫干法發(fā)酵工藝，發(fā)酵溫度為55℃，發(fā)酵pH值為7.3，發(fā)酵濃度為15%，發(fā)酵30 d，其中發(fā)酵原料60 g，接種物120 g，用蒸餾水配平至400 g，黃貯預處理組記為黃貯秸稈組，并以未經(jīng)處理的秸作為對照試驗組，每個處理組均設置3個平行。每7 d取1次發(fā)酵料液作為分析樣本，發(fā)酵第1天的最初始發(fā)酵原料即黃貯含水率為65%以上黃貯90 d的黃貯秸稈樣本，之后分別在發(fā)酵第7，14，21，28天取發(fā)酵料液作為分析樣本，該部分樣本每3 d分析一次木質纖維素組分變化、揮發(fā)性有機酸及微生物多樣性，每1 d記錄沼氣產量及甲烷含量，研究黃貯秸稈發(fā)酵產氣過程中底物組分變化規(guī)律。

1.3 試驗裝置

黃貯實驗采用2 L燒杯作為黃貯容器，具體詳見圖1。

圖1 預處理實驗裝置

發(fā)酵試驗采用沼氣潛力分析儀(BMP)作為試驗發(fā)酵裝置。具體連接如圖2所示。

1.水浴鍋； 2.脫除CO2的百里酚酞試劑； 3.氣體計數(shù)裝置圖2 厭氧發(fā)酵實驗裝置

1.4 試驗方法

1.4.1 秸稈原料的組分與結構分析

木質纖維素組分測定方法：將預處理后的原料，蒸餾水洗至中性，80℃烘干。將上述各樣品經(jīng)FW80萬能高速粉碎機粉碎，過1 mm藥典標準篩。稱取0.5000 g樣品置于F57濾袋中，封口機封口，運用ANKOM220型半自動纖維素分析儀對預處理各樣品中纖維素、半纖維素、木質素含量(即占總樣品干重的百分含量)分別進行分析測定，方法詳見范氏Van Soest纖維素測定法。

纖維素結晶度測定：采用x射線衍射(XRD)測定不同預處理條件秸稈纖維素結晶度(Equinox 5000X; Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA, USA)。秸稈樣品經(jīng)200目篩過濾，室溫壓實成薄片。然后通過Origin (OriginLab Co., Northampton, MA, USA)和MDI Jade 6.5 software (Materials data, Inc., Livermore, CA, USA)對數(shù)據(jù)進行分析和處理。采用Segal方法計算樣品中纖維素的結晶度指數(shù)(CrI)。

CrI(%)=((I002-Iam)/I002)×100

(1)

式中：I002為結晶區(qū)纖維素的衍射強度；Iam為非晶區(qū)纖維素的衍射強度。

對于纖維素I，在2θ=18°處獲得的的衍射強度即為m無定形區(qū)Ia纖維素的衍射強度；在2θ=22°處獲得的衍射強度即為晶體區(qū)I002的衍射強度，在2θ=22°附近有一個最大衍射峰，在2θ=18°附近有一個小的衍射峰。利用公式(1)可以從這些衍射強度中計算出秸稈中纖維素的相對結晶度[18]。

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)各組分采用島津 GC-2010Plus氣相色譜儀測定，使用StabilwaxDA30 m×0.53 mm×0.25 m型毛細管柱，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度為240℃，進樣器溫度為150℃，不分流，測定組分為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸。

1.4.2 厭氧發(fā)酵產氣效果分析

甲烷日產量及累積產氣量采用BMP分析儀測得。

1.5 試驗儀器與設備

ANKOM220型半自動纖維素分析儀(USA)；F57纖維素濾袋；封口機；高速萬能粉碎機FW80(天津)；藥典標準篩；精密pH計(PHS-3C)；DHZ-DA型電熱鼓風干燥機；馬弗爐(天津中環(huán)試驗電爐制造有限公司)；FA I 004 精密電子天平(上海精科天平廠)；島津 GC-2010Plus氣相色譜儀；Biogas便攜式沼氣分析儀。

2 結果與分析

2.1 黃貯預處理對秸稈組分結構的影響

通過90 d的黃貯預處理，研究了預處理前后玉米秸稈組分含量及結晶度的變化，可了解預處理技術對秸稈降解性的影響。

圖3 玉米秸稈組分含量

由圖3可知，黃貯后的秸稈木質纖維含量發(fā)生了改變，與未經(jīng)預處理的對照組相比，處理后秸稈的纖維素、半纖維素含量均有所降低，說明黃貯預處理有利于半纖維素和纖維素的降解；相對于對照試驗組，黃貯后秸稈的木質素含量有所增加，這可能與半纖維素與纖維素含量的減少有關，黃貯對秸稈中木質素的降解作用較小。

纖維素是由結晶區(qū)和無定形區(qū)連接而成的二相體系，纖維素結晶度的大小是反映與木質纖維類物質在處理過程中脫木素以及半纖維素溶出的一項重要指標。

圖4 玉米秸稈纖維素晶度

圖4為預處理前后玉米秸稈的XRD圖譜，從圖中可知，二者晶型結構相似，在2θ=220處均存在衍射峰，而在2θ=180的無定形區(qū)，說明預處理技術不改變秸稈晶型結構，但預處理后的秸稈無定形區(qū)峰值有所增加，無定形區(qū)是纖維素較易被分解的區(qū)域，說明黃貯使得纖維素的水解發(fā)酵更容易，有助于厭氧發(fā)酵產沼氣。

CrI 的高低反應了結晶區(qū)所占比例的大小。從結晶度結果看出，黃貯秸稈處理組，其秸稈結晶度CrI值較對照試驗即為未經(jīng)處理的對照組低，長時間的酸性黃貯環(huán)境引起了結晶纖維素的降解和纖維素結晶區(qū)內部羥基間氫鍵強度的變化，進而使纖維素的晶體結構改變，少量結晶區(qū)變成無定形區(qū)。

2.2 黃貯秸稈厭氧產氣性能研究

2.2.1 秸稈產氣效果分析

以黃貯后的秸稈和未經(jīng)處理的干玉米秸稈作為厭氧發(fā)酵原料，進行厭氧發(fā)酵產氣潛力試驗，共發(fā)酵30 d，每日記錄甲烷產量，產氣效果如圖5所示。

圖5 厭氧發(fā)酵過程中甲烷日產量

厭氧發(fā)酵產氣潛力結果可以用來分析黃貯玉米秸稈產沼氣能力，整個厭氧消化周期30 d，從甲烷日產量結果圖中可以看出，Untreated對照試驗組產氣效果較差，這可能與寒區(qū)玉米秸稈收獲后發(fā)干黃化，水分及組分含量損失、纖維素結晶度增大，所以在寒區(qū)未經(jīng)預處理的干玉米秸稈很難直接進行沼氣化利用；對于黃貯預處理組，從日產氣量上看，發(fā)酵前期有兩個產氣高峰，在發(fā)酵第3天有個產氣小高峰出現(xiàn)，甲烷日產量40.5 mL。

這可能與半纖維素及纖維素在發(fā)酵前期迅速降解有一定相關性，黃貯后秸稈木質纖維素結構被破壞，部分半纖維素、纖維素被水解產生還原糖，在將預處理后秸稈固液一同作為發(fā)酵原料后，纖維素半纖維素以及周邊組織中被分解為的小分子物質被微生物迅速降解為乙酸，這也可能導致發(fā)酵前期會出現(xiàn)一定量的乙酸累積，隨著發(fā)酵進程的繼續(xù)進行，組份中纖維素與半纖維素繼續(xù)被微生物分解利用產生乙酸等物質，再被甲烷菌利用轉化為甲烷，至此達到最大的產氣高峰。袁志慧[19]等研究發(fā)現(xiàn)NaOH預處理后玉米秸稈發(fā)酵前10 d系統(tǒng)由于纖維素、半纖維素的降解產生大量有機酸，抑制產甲烷菌生長，隨著發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定，有機酸被大量消耗，產氣量也隨之上升，這與本實驗有一定相似之處，但本實驗采用黃貯預處理，且固液相不需水洗可同時發(fā)酵，酸化過程只持續(xù)了4 d，之后有機酸被大量消耗產氣量在第10天即達到最大值，最大日產氣量為320 mL，發(fā)酵后期日產氣量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，直至發(fā)酵終止?？梢钥闯?，相對于NaOH預處理，黃貯預處理法在縮短酸化過程，提高系統(tǒng)產氣速率方面有一定優(yōu)勢。

圖6 厭氧發(fā)酵過程中甲烷累積產氣量

從圖6可知，甲烷累積產氣量結果中可以看出，黃貯預處理組發(fā)酵30 d的甲烷累積產氣量為2952 mL，是未經(jīng)處理的對照組的6.9倍，產氣量在發(fā)酵前10 d即出現(xiàn)日產氣最高峰時的甲烷累積產氣量達940 mL，為總累積產氣量的31.9%，而厭氧發(fā)酵時間可以指示發(fā)酵效率，在產氣高峰過后會有較長時間持續(xù)低產氣時期，在實際應用中以長時間的系統(tǒng)運行換取較小甲烷收益并不合算，所以采用消化時間DT80表示總產氣量達到80%需要的時間，在本實驗中DT80是在發(fā)酵第17天，此時累積產氣量為2428 mL，達總產氣了的80%，發(fā)酵17 d后產氣量逐漸減少至0 mL，總干物質產氣率為62.1 mL·g-1TS左右。

2.2.2 黃貯秸稈發(fā)酵過程中組分含量變化

從上述產氣結果可以看出，未經(jīng)預處理的干秸稈對照組產氣效果較差，所以在發(fā)酵過程中底物組分和有機酸含量變化只分析了黃貯處理組，即可說明黃貯處理后干玉米秸稈在發(fā)酵過程中底物與產物之間的代謝關系，以期為秸稈類生物質沼氣化利用過程發(fā)酵機理提供一定理論參考。

黃貯后的玉米秸稈發(fā)酵30 d，每5 d取樣分析底物組分含量，結果如圖7所示，發(fā)酵第1天即為黃貯后秸稈的組分含量，隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵底物即黃貯秸稈的纖維素、半纖維素、木質素組分含量都發(fā)生了一定的變化，具體結果如下。

圖7 厭氧發(fā)酵過程中秸稈組分含量

秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，黃貯秸稈組分含量在發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)不同的變化趨勢，其中纖維素半纖維素的含量均隨黃貯時間的延長而呈下降的趨勢，而木質素含量變化趨勢不顯著，說明厭氧發(fā)酵消耗的是秸稈原料中的纖維素與半纖維素成分，木質素則不易被降解，可見，可以利用用厭氧發(fā)酵后的料液提取木質素，以增加秸稈類原料資源化利用的附加值。

對于發(fā)酵時間為1d的試驗組，即為發(fā)酵原料黃貯秸稈的木質纖維素組分含量，黃貯后秸稈木質素含量為30.89%(以占干重百分比計，下同)、半纖維素含量為14.16%、木質素含量為19.2%，理論上通過黃貯預處理技術使得秸稈表面結構疏松、空隙增大，纖維素半纖維素被部分分解為微生物可利用的小分子物質存在于秸稈表面及周邊組織中，提高了微生物的可及度及分解速度，而從實際試驗所得不同發(fā)酵時間的各組分含量變化趨勢上可以看出，組分含量在發(fā)酵第3天有個比較明顯的下降趨勢，即在發(fā)酵前初期，半纖維素和纖維素迅速被微生物分解利用，半纖維和纖維素的含量分別降解到了12.35%，25.87%，與理論結果相似，即通過黃貯預處理后秸稈結構疏松，表面及周邊組織中存在很多易被分解的小分子物質，可迅速被厭氧微生物分解利用，此時由于微生物的降解產生的糖類被厭氧產氫產酸菌群分解產乙酸提供了充足的原料，理論上有機酸會在此階段大量累積，而有機酸的累積會抑制產甲烷菌產甲烷，因此發(fā)酵在此階段后會出現(xiàn)小幅下降趨勢，這與甲烷日產量中發(fā)酵第3天出現(xiàn)產氣高峰后又在第4天出現(xiàn)小幅下降的變化規(guī)律有一定相關性。

表1 秸稈原料發(fā)酵過程中組分降解率

由表1可以看出，隨著發(fā)酵進程的繼續(xù)進行，到發(fā)酵第6天時，半纖維素與纖維素下降趨勢有所減緩，到發(fā)酵第9天又出現(xiàn)了較大的降解趨勢，其中半纖維素與纖維素含量在第9天分別迅速下降到了6.99%，13.52%，與發(fā)酵初始原料黃貯秸稈相比分別降解了50.64%，56.23%，此時纖維素和半纖維素都已經(jīng)被降解超過50%，雖然半纖維素較纖維素更易被水解利用，但部分半纖維素包含在纖維素中，所以當部分纖維素發(fā)生水解后，其中包含的半纖維素才能被完全水解[20]。到此可以稱之為發(fā)酵前期，即在發(fā)酵前期，由于黃貯預處理技術的作用秸稈中纖維素與半纖維素可被厭氧微生物迅速分解利用。到發(fā)酵后期，隨著纖維素的部分水解，微生物可觸及的半纖維素面積進一步增大，半纖維素繼續(xù)被迅速分解，直到發(fā)酵結束半纖維素已被降解到了0.89%，降解了94%，幾乎被降解完全，可見半纖維素是一種在厭氧產沼氣環(huán)境中可以被厭氧微生物完全降解的物質，所以由此可以推斷只要將包裹在半纖維素外的物質破壞，或者通過某種手段分解，半纖維素就可以被完全利用，而纖維素組成結構中包括結晶區(qū)和無定形區(qū)兩相，經(jīng)過黃貯預處理后秸稈中纖維素的部分結晶區(qū)已轉變?yōu)槿菀妆唤到獾姆墙Y晶區(qū)，所以纖維素在發(fā)酵前期出現(xiàn)降解較快的趨勢，而到了發(fā)酵后期，結晶區(qū)在短期內較難降解，纖維素的降解速率明顯減慢，與發(fā)酵初期相比僅降解了22.72%，但總體來看，在整個厭氧發(fā)酵過程中，纖維素被降解了78.95%，仍有21%的纖維素沒有被降解，這部分未被分解利用的纖維素仍有待進一步研究以提高纖維素的降解率。

秸稈中木質素是一種芳香族高分子聚合物，是不能被分解利用的物質，但木質素在木質結構的最外層，將纖維素與半纖維素包裹其中，所以通過一定預處理技術破壞這種連接，以提高秸稈降解效率。從圖7中可以看出木質素整體含量有一定減少，但減少趨勢很緩，隨著發(fā)酵時間的進行，其含量與發(fā)酵前相比，減少了29.86%，可見木質纖維素結構的生物質中，木質素成分被少部分降解，這可能是由于黃貯預處理破壞了木質素的結構，就能使得纖維素被大部分降解，進一步使得最容易被降解的半纖維素被全部降解，所以在發(fā)酵前通過一定的預處理技術破壞木質纖維素結構，就能顯著提高纖維素、半纖維素的降解效率。

2.2.3 黃貯秸稈厭氧發(fā)酵過程中有機酸的變化

有機酸來自于有機物的水解酸化產物，原料中易分解有機物含量越高水解酸化的速率越高，有機酸積累量越高。而有機酸組分則主要取決于發(fā)酵原料的特性。 黃貯秸稈厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液揮發(fā)性有機酸含量的變化見下圖，由圖8可知，黃貯秸稈厭氧發(fā)酵過程中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)主要由乙酸、丙酸和丁酸組成。

圖8 厭氧發(fā)酵過程中有機酸含量

從圖8中可以看出黃貯秸稈在發(fā)酵過程中有機酸含量變化規(guī)律不同。隨著發(fā)酵時間的延長總有機酸(TVFA)含量變化呈先升高后下降的趨勢，在發(fā)酵前3 d迅速增加并達到最大值，總有機酸含量達到12670 mg·L-1，發(fā)酵3 d后總有機酸含量逐漸降低。在發(fā)酵初期有機酸大量累積說明黃貯預處理后有加快秸稈水解的作用，消化過程中乙酸、丙酸和丁酸的變化如圖8所示，在發(fā)酵前3 d乙酸濃度迅速累積，并在發(fā)酵第3天達到最大值10910 mg·L-1，可見秸稈厭氧發(fā)酵過程以乙酸發(fā)酵型為主。厭氧發(fā)酵3 d后即隨著厭氧發(fā)酵過程推進，乙酸含量呈明顯下降趨勢；丁酸含量與乙酸含量變化趨勢相同，但發(fā)酵過程中丁酸含量很少，最大值在發(fā)酵第9天為500 mg·L-1，丙酸含量并未表現(xiàn)出相同的趨勢，丙酸含量呈現(xiàn)出先穩(wěn)定增加后逐漸減少的趨勢，其濃度達到6000 mg·L-1。 通常乙酸可直接被產甲烷菌利用，而丙酸首先由產氫產乙酸菌轉化為乙酸和氫氣，然后才能被產甲烷菌利用。許多研究結果表明，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中，產氫產乙酸菌可能對有毒物質或環(huán)境因素變化更加敏感，相比較乙酸、丁酸，丙酸更不易被產甲烷菌所利用轉化，此外，丙酸的積累反過來又可能會對產甲烷菌造成抑制作用。

3 結論

通過上述試驗，得出黃貯秸稈在厭氧發(fā)酵過程中的木質纖維素底物與代謝產物有機酸即沼氣產量的結果如下：

(1)黃貯秸稈在發(fā)酵初期即發(fā)酵前3 d，纖維素與半纖維素降解速度較快、乙酸含量迅速增加，甲烷日產量在發(fā)酵第3天出現(xiàn)第1個小高峰，可見在發(fā)酵前期，將黃貯預處理后的秸稈固液相一同作為發(fā)酵底物，底物中可直接水解產酸物質增加，產甲烷菌產甲烷速率增加，進而使得發(fā)酵系統(tǒng)啟動速率提高，但隨著產酸底物的累積，產甲烷菌群出現(xiàn)了短暫的抑制階段，所以通過研究發(fā)現(xiàn)若能在此階段采用一定技術手段減少這種抑制作用，會對甲烷產氣速率的進一步提高有一定促進作用。

(2)在黃貯秸稈厭氧發(fā)酵中期，纖維素與半纖維素基本被降解完全，發(fā)酵后期纖維素與半纖維素不再被降解，這與發(fā)酵前經(jīng)過黃貯預處理后秸稈結構疏散易降解性提高有一定關系，木質素基本不參與整個發(fā)酵過程，減少的部分可能也與黃貯預處理后秸稈中木質素被部分破壞有關，可見發(fā)酵后期底物組分中主要是木質素，可考慮使用黃貯秸稈發(fā)酵后底料對木質素進行回收，提高寒區(qū)干玉米秸稈資源化利用的附加值。

(3)黃貯預處理后的秸稈產氣量是未經(jīng)預處理的干玉米秸稈對照組產氣量的7.9倍，可見在寒區(qū)黃貯預處理技術不僅在預處理方法上解決了秸稈原料的季節(jié)性和時效性問題，保證了寒區(qū)秸稈原料的全年穩(wěn)定供應，還在提高秸稈的生物降解率的同時減少了發(fā)酵抑制物的產生，解決了秸稈燃料化利用過程的低效率高成本問題，而且提高了秸稈沼氣產氣效率。試驗為將黃貯法應用于寒區(qū)秸稈沼氣工程上提供了理論參考，但黃貯的預處理時間在90 d左右，可通過添加微生物菌劑等方法縮短黃貯時間，以進一步提高秸稈利用效率。