余燕婷 朱潤章 肖磊娟 王聰 李曉峰 季大璽

210019 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京明基醫(yī)院腎臟內(nèi)科

糖尿病發(fā)病率逐年增加，有1/3糖尿病患者可發(fā)展成糖尿病腎病，表現(xiàn)為尿白蛋白或尿總蛋白增加。糖尿病腎病尚無有效治療方式，隨著腎功能進(jìn)展，既往控制尿蛋白的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑以及中成藥雷公藤等均需慎用[1]。因此，尋找糖尿病腎病的治療藥物具有重要臨床意義。硫化氫(H2S)是繼一氧化碳、一氧化氮之后的第三種氣體信號分子[2]，在哺乳動物體內(nèi)多個組織、器官均有內(nèi)源性的H2S產(chǎn)生[3]。在H2S的合成酶學(xué)途徑和非酶學(xué)途徑中，酶學(xué)途徑占主要地位，涉及胱硫醚β合成酶(cystathionine betasynthetase，CBS)、胱硫醚β裂解酶(cystathionine beta-lyase，CSE)、3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(3-mercaptopyruvate transferase，MST)[4]，三種酶在腎臟近端小管上皮細(xì)胞均有表達(dá)[5]。H2S的生理作用涉及血管舒張、抗氧化、抗炎、抗凋亡、促血管生成[6]。H2S對腎臟穩(wěn)態(tài)起重要作用，具有利尿、排鈉、排鉀等作用[7]。在慢性腎臟病(CKD)動物模型，血漿H2S濃度下降，腎組織H2S減少。臨床上規(guī)律血液透析的終末期腎臟病(ESRD)患者的血漿H2S水平較健康對照者也下降[8]，而糖尿病是一個多基因多因素參與的疾病，發(fā)病機(jī)制涉及氧化應(yīng)激[9]。H2S作為一個還原劑，是否對糖尿病腎病起保護(hù)作用呢？相關(guān)的研究并不多。本實(shí)驗(yàn)旨在研究H2S在糖尿病腎病中的作用及探討其可能的機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對象

1.實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6J小鼠給予STZ(#S0130，sigma-aldrich)50 mg/kg×4 d腹腔注射，自第一次注射開始2周后測隨機(jī)血糖超過16.7 mmol/L為糖尿病造模成功，后續(xù)所有動物給予高脂飲食。將造模成功小鼠分兩組：STZ+GYY 4137組(H2S組)給予20 mg/kg GYY 4137(sigma，SML0100)腹腔注射，STZ+生理鹽水組(DKD組)給予等量生理鹽水腹腔注射。另外取正常C57BL/6J-1小鼠作為正常對照組(control組)，給予等量生理鹽水腹腔注射。連續(xù)注射12周。12周后留取24 h尿液，測尿白蛋白含量。并處死小鼠，留取腎組織，在光鏡下行PAS染色觀察，取腎組織勻漿檢測CBS、CSE、MST的水平，光鏡石蠟切片行TUNEL檢測。

2.細(xì)胞 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞系(NRK-52E，CRL-1571TM)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。用含10%胎牛血清和100 U/mL青-鏈霉素的DMEM低糖(5.5 mmol/L)培養(yǎng)基(#D5546，sigma-aldrich)，在37 ℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長達(dá)到80%融合后，換成無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基孵育過夜(16 h)，再次更換無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，給予D-葡萄糖和甘露醇刺激6 h、12 h、24 h、48 h，檢測caspase-3的活性。取12 h的時間點(diǎn)，H2S預(yù)孵后再次檢測高糖刺激后caspase-3的活性變化。

二、方法

1.生化指標(biāo)檢測 自注射GYY4137第12周末，測量大鼠空腹體質(zhì)量，用10%水合氯醛麻醉，摘取眼球后取血，離心后取血清用自動生化分析儀檢測空腹血糖、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、白蛋白(albumin，Alb)。并檢測24 h尿白蛋白水平。

2.腎臟形態(tài)學(xué)變化觀察 小鼠處死后，速取兩側(cè)腎臟，去除包膜，左腎分裝后置于-80 ℃冰箱保存；右腎置10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，PAS染色：1%高碘酸氧化15 min，純水洗3～5遍；Schiff氏液染30 min，流水沖洗至顏色轉(zhuǎn)為玫瑰紅；蘇木素淡染，水洗，脫水，透明，封片。光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化。TUNEL染色：石蠟切片脫蠟、脫水，滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，20～37 ℃作用15～30 min，加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次后，用抗熒光淬滅封片液封片后，置于熒光顯微鏡下觀察。

3.Western blot檢測腎組織和細(xì)胞蛋白的表達(dá) 取腎臟組織50 mg，加細(xì)胞裂解液勻漿，離心后取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取30 μg上樣，SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%TBST脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入一抗1∶400稀釋的CBS(sc-67154，santa cruz)、CSE(sc-101924，santa cruz)、MST(HPA001240，sigma)多克隆抗體，1∶1000稀釋的β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，二抗孵育1 h，濃度為1∶1000?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯色，曝光成像。凝膠成像系統(tǒng)測定條帶的灰度值，計算CBS、CSE、MST的蛋白相對表達(dá)量。同法檢測細(xì)胞的caspase-3(#14220, Cell Signaling Technology, Beverly, MA),cleaved-caspase-3(#9664, Cell Signaling Technology, Beverly, MA)的蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組小鼠生化指標(biāo)水平比較

糖尿病腎臟病(DKD)組尿白蛋白水平顯著高于Control組(144.6±61.0 vs 34.9±13.9 mg，P<0.05)，H2S組尿白蛋白較DKD組顯著下降(46.6±47.2 vs 144.6±61.0，P<0.05)。與Control組相比，DKD組小鼠體質(zhì)量顯著下降(31.4±3.8 vs 37.8±7.7 g，P<0.05)，但BUN、Scr、Alb水平無明顯差異(P>0.05)；H2S治療對小鼠體質(zhì)量、血糖等無明顯影響。(表1)

表1 各組小鼠生化指標(biāo)水平比較±s)

注：與Control組比較，aP<0.05，與DKD組比較，bP<0.05

二、各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)比較

取小鼠腎組織切片行PAS染色，觀察各組小鼠腎小球系膜增殖情況。與Control組相比，DKD組小鼠系膜細(xì)胞增多，系膜基質(zhì)增生；H2S治療后系膜細(xì)胞增生減少，系膜基質(zhì)增殖也減輕。(圖1)

三、各組小鼠腎組織CBS、CSE、MST蛋白相對表達(dá)量比較

DKD組小鼠腎組織CBS蛋白較Control組小鼠表達(dá)減少(P<0.05)，而DKD組和Control組小鼠腎組織的CSE、MST表達(dá)無明顯差別(P>0.05)。(圖2)

圖2 各組小鼠CBS、CSE、MST的蛋白相對表達(dá)量比較(A.三種H2S產(chǎn)生酶在正常和糖尿病小鼠腎組織表達(dá)，B.H2S產(chǎn)生酶CBS的蛋白相對含量，C.H2S產(chǎn)生酶CSE的蛋白相對含量，D.硫化氫產(chǎn)生酶MST的蛋白相對含量；與Control組比較，aP<0.05)

四、各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況比較

小鼠腎組織切片行脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞的凋亡。與Control組相比，DKD組小鼠腎組織TUNEL檢測陽性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)，H2S治療后TUNEL檢測陽性細(xì)胞數(shù)較前明顯減少(P<0.05)。(圖3)

圖3 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況比較(A.Control組，B.DKD組，C.H2S組，D.各組小鼠腎組織TUNEL染色陽性細(xì)胞的百分比；與Control組比較，aP<0.05；與DKD組比較，bP<0.05)

五、H2S對腎小管上皮細(xì)胞caspase-3的作用

對大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)給予25 mmol/L葡萄糖刺激，凋亡標(biāo)志物cleaved-caspase-3的表達(dá)明顯增加，刺激6 h、12 h時其增加具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。提前給予不同濃度(10、50、100 μmol/L)H2S預(yù)孵30 min再給予25 mmol/L葡萄糖刺激12 h，cleaved-caspase-3的表達(dá)均降低(P<0.05)。(圖4)

圖4 H2S對腎小管上皮細(xì)胞cleaved-caspase-3和caspase-3的作用[A.大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞在高糖(葡萄糖25 mmol/L)刺激后較正常葡萄糖(5.5 mmol/L)，cleaved-caspase-3/caspase-3表達(dá)增加，B.不同濃度H2S預(yù)孵后進(jìn)行高糖刺激，cleaved-caspase-3/caspase-3表達(dá)降低；HG為高糖組；與Control組比較，aP<0.05，與HG組比較，bP<0.05]

討 論

H2S是新型氣體分子，在生物體內(nèi)多個系統(tǒng)顯示有治療作用[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)H2S在慢性腎臟病患者體內(nèi)下降[8,11]，動物實(shí)驗(yàn)顯示H2S能夠改善梗阻性腎病的腎臟纖維化[12]，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2S能夠改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞基質(zhì)蛋白的合成[13]，但H2S對糖尿病腎病的作用研究較少。本研究用STZ小劑量多次腹腔注射，并給予高脂飲食誘導(dǎo)制備糖尿病腎病模型，尿白蛋白增加是糖尿病腎病造模成功標(biāo)志，對糖尿病腎病模型小鼠給予H2S治療后，尿白蛋白明顯改善，提示H2S能夠改善糖尿病小鼠腎損傷。不僅尿白蛋白改善，對腎組織形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)H2S能改善腎小球系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)增殖。

硫化氫在眾多疾病中均下降，包括急性腎損傷，心肌纖維化，腦認(rèn)知功能障礙等。但硫化氫產(chǎn)生酶的研究尚少，H2S產(chǎn)生酶包括CBS、CSE、MST。既往有研究發(fā)現(xiàn)CSE能夠保護(hù)腎臟缺血再灌注損傷[12]。本研究用蛋白印跡法檢測三種酶在腎臟的具體表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠較正常對照CBS的表達(dá)明顯下降，CSE和MST的表達(dá)沒有明顯變化，提示H2S產(chǎn)生酶CBS的減少可能是糖尿病小鼠H2S產(chǎn)生減少的原因。

H2S的供體既往有硫氫化鈉，Zhou等[14]研究結(jié)果顯示，外源性給予糖尿病大鼠NaHS 14 μmol/kg后能夠改善腎功能指標(biāo)和病理結(jié)構(gòu)損傷。楊悅等[15]的研究顯示，通過外源性給予大鼠補(bǔ)充H2S的供體NaHS 56 μmol/kg后，NaHS組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)與對照組無顯著差異；而與糖尿病組相比，NaHS治療組大鼠體質(zhì)量明顯增加，空腹血糖、BUN、Scr、24 h尿蛋白、腎質(zhì)量和腎質(zhì)量指數(shù)均明顯降低，形態(tài)學(xué)損傷明顯改善，結(jié)果顯示外源性補(bǔ)充H2S對糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。但NaHS缺點(diǎn)是釋放快，對使用者有一定危害。GYY4137是新型的H2S緩釋制劑[16]。研究發(fā)現(xiàn)GYY4137對高糖的細(xì)胞毒性起保護(hù)作用，其機(jī)制是通過AMPK/mTOR信號途徑發(fā)揮作用[17]。本研究通過GYY4137給STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠補(bǔ)充H2S，發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量增加，尿蛋白減少，腎小球的系膜增生改善，提示緩釋劑GYY4137作為H2S供體對糖尿病腎病具有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病的發(fā)展中起一定作用[18]，研究發(fā)現(xiàn)H2S通過巰基化核因子-κB起抗凋亡作用[19]。TUNEL檢測可反映細(xì)胞的凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病小鼠腎組織中TUNEL檢測染色陽性的細(xì)胞數(shù)增多，而H2S治療組陽性細(xì)胞減少。caspase-3常作為凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶，本實(shí)驗(yàn)對大鼠來源的近端腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E細(xì)胞給予高糖刺激后，caspase-3活性明顯升高，而H2S預(yù)孵育可使caspase-3活性降低，提示H2S通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)腎臟。本研究選取近端腎小管上皮細(xì)胞系，原因是H2S探針發(fā)現(xiàn)小管H2S產(chǎn)生較腎小球明顯增加，而且腎組織免疫組化也發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞主要在腎小管上皮細(xì)胞，而且有研究發(fā)現(xiàn)H2S能夠抑制高糖誘導(dǎo)的近端小管上皮細(xì)胞基質(zhì)蛋白的表達(dá)[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)對糖尿病小鼠外源性補(bǔ)充H2S緩釋制劑GYY4137，能夠減輕小鼠尿白蛋白，減輕腎小球系膜增殖，減少腎組織細(xì)胞凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)，H2S可能通過降低caspase-3活性而減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提示GYY4137作為H2S的緩釋制劑，有望成為糖尿病腎病的治療新舉措。