趙瑋 郭龍宗 張孝蘭 李燕 石海春 王雪梅 侯珍珍

中圖分類號(hào)：S858.31???? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C???? 文章編號(hào)：1673-1085（2020）3-0046-03

沙門氏菌病為人畜共患病，在食品安全及公共衛(wèi)生上極為重要。沙門氏菌無處不在，廣泛分布于各種動(dòng)物和環(huán)境中。沙門氏菌可存在于雞群中，但并不一定引起發(fā)病，在雞群受到應(yīng)激或垂直傳播時(shí)可引起種雞或雛雞發(fā)病。沙門氏菌抵抗力較強(qiáng)，在環(huán)境中可長(zhǎng)期存活，在蛋殼表面可存活200d，在塵埃中可存活3年之久，對(duì)陽性雞舍進(jìn)行徹底消毒十分困難。所以在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，對(duì)雞群生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)尤為重要，本文就針對(duì)怎樣有效的從污染物中分離沙門氏菌以及選用什么樣的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)沙門氏菌做了一系列的實(shí)驗(yàn)，供大家參考。

1? 實(shí)驗(yàn)原理、方法

1.1? 我們首先將容易干擾沙門氏菌生長(zhǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌、變形桿菌）與沙門氏菌接種到不同的培養(yǎng)基，再將常見的不同血清的沙門氏菌接種到不同培養(yǎng)基，觀察其生長(zhǎng)形態(tài)，結(jié)合兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)組合來有效的鑒別沙門氏菌。

1.2? 由于環(huán)境中存在的大多數(shù)沙門氏菌為腸炎型的沙門氏菌，通過添加少量腸炎型沙門氏菌，人工模擬雞舍內(nèi)沙門氏菌陽性的墊料，用不同的增菌液增菌，再傳代到沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基，依據(jù)從污染物中檢出沙門氏菌的結(jié)果，選擇優(yōu)勢(shì)的增菌液與鑒別培養(yǎng)基。

2? 實(shí)驗(yàn)試劑、材料

2.1? 實(shí)驗(yàn)試劑? 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，麥康凱瓊脂，SS瓊脂，亮綠瓊脂（BG），DHL瓊脂，XLD瓊脂，XLT4瓊脂，緩沖蛋白胨水（BPW），亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC），氯化鎂孔雀綠增菌液（MM），液體連四硫酸鹽（USP）（FTM）帶有配套試劑碘液和煌綠，以上試劑均購(gòu)買自青島海博生物有限公司，沙門氏菌單因子診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司，生理鹽水、蒸餾水。

2.2? 實(shí)驗(yàn)材料? 腸炎型沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、變形桿菌（均為已鑒定的純化菌株），木花、稻殼（沙門氏菌陰性），雞糞（沙門氏菌陰性），移液器（20～200μL、100～1000μL），吸頭（200μL、1000μL），接種針，酒精燈，三角燒瓶，平口試管帶試管塞，平皿。

3? 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1? 鑒別培養(yǎng)基的選擇

3.1.1? 制備瓊脂平板：按照產(chǎn)品說明將普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、BG瓊脂、DHL瓊脂、XLD瓊脂、XLT4瓊脂制備成瓊脂平板。

3.1.2? 將大腸桿菌、變形桿菌、腸炎型沙門氏菌的純化的菌株傳代于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、亮綠瓊脂、DHL瓊脂、XLD瓊脂、XLT4瓊脂、倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。

3.1.3? 菌株在不同培養(yǎng)基的鑒別結(jié)果見圖1。

由圖1可見，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂可以區(qū)分變形桿菌與腸炎型沙門氏菌，但不宜區(qū)分大腸桿菌與腸炎型沙門氏菌;DHL瓊脂、麥康凱瓊脂可以區(qū)分大腸桿菌與腸炎型沙門氏菌，但不宜區(qū)分變形桿菌與腸炎型沙門氏菌;亮綠瓊脂不宜區(qū)分大腸桿菌、腸炎型沙門氏菌、變形桿菌;SS、XLD、XLT4可以明顯的區(qū)分大腸桿菌、腸炎型沙門氏菌、變形桿菌。

3.1.4? 將雞白痢沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎型沙門氏菌分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、XLT4瓊脂，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱、XLT4可以區(qū)分雞白痢沙門氏菌與腸炎型沙門氏菌，XLT4可以區(qū)分雞白痢沙門氏菌、腸炎型沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌。

由以上結(jié)果可以看出，在分離培養(yǎng)沙門氏菌時(shí)可以選用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、XLT4瓊脂、麥康凱瓊脂組合，這樣可以快速有效地發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的可疑菌落。

3.2? 增菌液的選擇

3.2.1? 菌液制備? 將純化的腸炎型沙門氏菌涂于平板37℃溫箱培養(yǎng)24h，用生理鹽水稀釋，用平板點(diǎn)樣計(jì)數(shù)法調(diào)菌液濃度為102、103CFU/mL。

3.2.2? 墊料的制備? Ⅰ組只將木花和稻殼混合不加雞糞;Ⅱ組將木花、稻殼、雞糞混合均勻，模擬雞舍內(nèi)墊料。

3.2.3? 制備增菌液及平板? 按照說明分別配制緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、氯化鎂孔雀綠增菌液（MM）、液體連四硫酸鹽（USP）（FTM），滅菌分裝備用，以下以BPW、SC、MM、FTM代替增菌液名稱;將普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、XLT4瓊脂制備成瓊脂平板備用。

3.2.4? 實(shí)驗(yàn)分組? A組選用BPW為前增菌液，SC、MM、FTM增菌液，分別標(biāo)記為A-SC、A-MM、A-FTM;B組SC為前增菌液，SC為增菌液;C組MM為前增菌液，MM為增菌液;D組FTM為前增菌液，F(xiàn)TM為增菌液，A～D組分別再做添加不同量沙門氏菌菌液的三組對(duì)比，即不添加沙門氏菌菌液、添加100μL 102CFU/mL沙門氏菌菌液、添加100μL 103CFU/mL沙門氏菌菌液。

3.2.5? 實(shí)驗(yàn)方法、步驟（無菌操作）

3.2.5.1? 準(zhǔn)確稱量25gⅠ組墊料加到225ml的BPW、SC、MM、FTM前增菌液中混勻，A組前增菌液做六個(gè)重復(fù)，即A1-SC、A1-MM、A1-FTM、A2-SC、A2-MM、A2-FTM、A3-SC、A3-MM、A3-FTM;B、C、D組前增菌液做三個(gè)重復(fù)，即B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3;準(zhǔn)確稱量25gⅡ組墊料加到225ml的BPW、SC、MM、FTM前增菌液中混勻，A組前增菌液做六個(gè)重復(fù)，即A1'-SC、A1'-MM、A1'-FTM、A2'-SC、A2'-MM、A2'-FTM、A3'-SC、A3'-MM、A3'-FTM;B、C、D組前增菌液做三個(gè)重復(fù)，即B1'、B2'、B3'，C1'、C2'、C3'，D1'、D2'、D3'。

3.2.5.2? A1-SC、A1-MM、A1-FTM、B1、C1、D1、A1'-SC、A1'-MM、A1'-FTM、B1'C1'D1'前增菌培養(yǎng)中不添加沙門氏菌菌液;吸取100μL 102CFU/mL沙門氏菌菌液添加到A2-SC、A2-MM、A2-FTM、B2、C2、D2、A2'-SC、A2'-MM、A2'-FTM、B2'、C2'、D2'的前增菌液中搖勻;吸取100μL 103CFU/mL沙門氏菌菌液添加到A3-SC、A3-MM、A3-FTM、B3、C3、D3、A3'-SC、A3'-MM、A3'-FTM、B3'、C3'、D3'的前增菌液中搖勻，37℃溫箱培養(yǎng)24h。

3.2.5.3? 培養(yǎng)后產(chǎn)物增菌：取前增菌培養(yǎng)物1mL加入9ml相對(duì)應(yīng)的增菌液中37℃溫箱培養(yǎng)24h。

3.2.5.4? 培養(yǎng)基平板傳代：用接種針取增菌培養(yǎng)物一環(huán)劃線于培養(yǎng)基平板，分別為普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、XLT4瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h。

3.2.6? 培養(yǎng)結(jié)果? 見表1。

3.2.7? 結(jié)果判定? 將分離到的可疑沙門氏菌純化傳代，進(jìn)行單因子診斷血清凝集實(shí)驗(yàn)，凝集A-F多價(jià)血清，凝集O9、O12、Hg、Hm，診斷為腸炎型沙門氏菌。

由以上實(shí)驗(yàn)可以看出BPW前增菌液對(duì)沙門氏菌的選擇性不高，當(dāng)樣品被大量其他細(xì)菌污染、沙門氏菌含量較少不是優(yōu)勢(shì)菌群時(shí)，沙門氏菌不宜分離到，F(xiàn)TM對(duì)沙門氏菌的增菌效果要好于SC，MM增菌效果比SC差，所以對(duì)污染物進(jìn)行沙門氏菌分離時(shí)用FTM兩次增菌效果較好，能快速有效的分離沙門氏菌。

4? 結(jié)論

對(duì)雞群環(huán)境進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)是對(duì)雞群健康監(jiān)控的有效手段，選用合適的培養(yǎng)基可確保我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。由以上實(shí)驗(yàn)可以看出，樣品較為干凈、雜菌較少時(shí)，可用BPW進(jìn)行前增菌，SC或MM或FTM增菌，再結(jié)合普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱、XLT4的有效組合可以有效分離沙門氏菌，當(dāng)樣品較臟、雜菌較多而沙門氏菌含量較少不是優(yōu)勢(shì)菌群時(shí)，用FTM兩次增菌，再結(jié)合普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱、XLT4組合效果較好，能快速有效的分離沙門氏菌?！?/p>

收稿日期：2020-03-20