孫晨，何秋霞，高燕，張磊，李寧，劉可春*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所，a. 山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術(shù)研究中心；b. 山東省生物檢測技術(shù)工程實驗室，山東 濟南 250103; 2.澳大利亞聯(lián)邦藥物管理局 生物部，澳大利亞 西蒙斯頓 2609)

2019年12月，中國湖北省武漢市的部分醫(yī)院陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不明原因肺炎病例，后被證實是由一種新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染所引起的急性呼吸道類傳染疾病(新冠肺炎)。新冠肺炎現(xiàn)已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并按照甲類傳染病管理，其具有傳染性強、潛伏期長、傳播途徑復(fù)雜等特點，感染患者的臨床表現(xiàn)多樣。大多數(shù)患者在發(fā)病時伴有輕微的發(fā)燒、咳嗽、肌痛、氣促或疲勞等癥狀。在危重癥患者中，感染可導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[1]。臨床數(shù)據(jù)表明， 2019-nCoV感染的危重患者多為老年人、高血壓患者、糖尿病患者等有基礎(chǔ)疾病的人群[2]。截至2020年2月，2019-nCoV已在中國感染七萬余人，并導(dǎo)致兩千余人死亡[3]。

疫苗免疫是防控病毒感染的最有效策略，但是由于目前還沒有專門針對2019-nCoV的疫苗，因此臨床上對新冠肺炎仍以對癥支持治療為主，主要治療方法包括抗病毒藥物治療，如洛匹那韋與利托那韋聯(lián)合用藥、利巴韋林等；中醫(yī)藥治療，如雙黃連、連花清瘟和甘草酸等；以及新冠狀病毒特免血漿品治療等[4-5]。

雖然世界各地的研究小組現(xiàn)正加緊步伐開發(fā)研制2019-nCoV的針對性疫苗，但是疫苗研發(fā)是一個比較耗時的過程，且2019-nCoV是一種新的病毒，目前對其認(rèn)識還不是非常清楚，因此在疫苗的研發(fā)過程中還存在一些不確定的因素，2019-nCoV的特效疫苗應(yīng)用到臨床的具體時限仍未可知。考慮到當(dāng)前疫情的嚴(yán)重性，本文對同為RNA病毒的流感病毒、其他冠狀病毒相關(guān)疫苗的研究進行了綜述，分析了現(xiàn)有病毒疫苗用于防治新冠肺炎的可行性，旨在找到一種可用于該疾病短期防控的替代物。

1 流感病毒

1.1 一般特征

流感病毒是一種可引起類似感冒癥狀的呼吸道病毒，主要引起高熱、乏力、全身酸痛及呼吸道癥狀[6]。 流感病毒的感染傳播非常迅速，流行性感冒即是由該病毒引起的一類嚴(yán)重威脅人類健康的急性呼吸道傳染病，全球范圍內(nèi)每年約有29萬～65萬人死于季節(jié)性流感病毒感染[7]。流感病毒主要通過飛沫傳播，老年人、兒童、孕婦、免疫缺陷人群以及有慢性基礎(chǔ)疾病的人群均是易感染流感病毒的高危人群[8]。

流感病毒屬于正黏病毒科，重要的遺傳信息儲備在單鏈RNA中，可編碼血凝素 (hemagglutinin，HA) 糖蛋白、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)、核蛋白(nucleoprotein，NP)、基質(zhì)蛋白(matrix protein)和非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein)等[9]。其中HA糖蛋白由流感病毒基因片段4編碼而來，以同源三聚體的形式跨膜存在于流感病毒的包膜中。成熟的HA糖蛋白外觀像蘑菇，包括頭部與莖部。頭部具有很高的變異性，由HA1結(jié)構(gòu)域組成。該結(jié)構(gòu)域含有受體結(jié)合位點與抗原決定簇，主要負(fù)責(zé)識別并結(jié)合宿主細胞表面的唾液酸受體，并可刺激宿主機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[10]。莖部由HA2和小部分HA1結(jié)構(gòu)域組成，主要介導(dǎo)流感病毒與宿主細胞膜的融合，是流感病毒相對保守的區(qū)域[11-12]。根據(jù)流感病毒的核蛋白與基質(zhì)蛋白，可將其分成4型，分別是A、B、C和D型，其中A、B和C型可感染人類。A型流感病毒因其HA位點的結(jié)構(gòu)常易發(fā)生突變，因此流行規(guī)模通常較大，根據(jù)其HA和NA的蛋白結(jié)構(gòu)與基因特性可分為多種亞型，在鳥類和哺乳動物中，目前已確定了18個HA和11個NA亞型[6]。B型流感病毒只有一個亞型，根據(jù)抗原性和HA1區(qū)的核苷酸序列基因特性，在1990年將其分成兩大譜系，簡稱Victoria系和Yamagata系。B型流感病毒流行規(guī)模較小[6,13]。C型流感病毒一般呈散發(fā)流行，且病情較輕。目前，引起流感季節(jié)性流行的病毒主要是A型中的H1N1、H3N2亞型和B型中的Victoria和Yamagata系。全球已上市的季節(jié)性流感疫苗，也主要針對上述4種流感病毒[14]。

1.2 流感疫苗

世界衛(wèi)生組織每年對流感進行全球性監(jiān)測，定期更改用于疫苗生產(chǎn)的推薦病毒疫苗株[15]。由于流感病毒是通過HA糖蛋白識別并進入宿主細胞的，因此目前已上市的流感疫苗主要以HA糖蛋白作為主要靶點。當(dāng)流感疫苗作用機體后，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生靶向HA糖蛋白的中和抗體，該抗體可與HA糖蛋白相互作用，進而阻斷病毒顆粒附著和進入宿主細胞[16-17]。根據(jù)感染性與毒性的有無，可將全球已上市的流感疫苗分為滅活流感疫苗(inactivated influenza vaccine，IIV)和減毒流感疫苗(live attenuated influenza vaccine， LAIV)。按照疫苗所含成分，流感疫苗又可分為三價與四價。三價疫苗自1978年開始投入使用，目前的三價流感疫苗組份中含有H1N1亞型、H3N2亞型和B型流感病毒株的Victoria系。2012年12月，葛蘭素史克公司研發(fā)出四價流感疫苗，該疫苗在原來三價的基礎(chǔ)上又增加了1個B型流感病毒株(Yamagata系)。根據(jù)生產(chǎn)工藝，流感疫苗又可分為基于雞胚、基于細胞培養(yǎng)和重組流感疫苗[18]。

我國現(xiàn)已批準(zhǔn)上市的流感疫苗包括三價滅活流感疫苗和四價滅活流感疫苗。其中三價滅活流感疫苗包括裂解疫苗和亞單位疫苗，適用于6月齡及以上的人群接種；四價滅活流感疫苗為裂解疫苗，適用于36月齡及以上的人群接種。根據(jù)我國國家藥監(jiān)局網(wǎng)站和疫苗批簽發(fā)信息，2019—2020年，有7家廠家供應(yīng)流感疫苗 (表1)。除此之外，一種鼻噴三價流感減毒疫苗正在上市審批過程中，其適用于3～17歲人群[14]。

表1 2019—2020年國內(nèi)批簽發(fā)的流感疫苗

2 冠狀病毒

冠狀病毒(corvonavirus, CoV)是一種單鏈正義RNA病毒，基因總長約為28～32 kb，屬于冠狀病毒科。是目前發(fā)現(xiàn)最大的RNA類病毒，基因組大致可分成6至7個區(qū)，每個區(qū)域均包含1至多條開放閱讀框(opten-reading frame，ORF)。CoV主要有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是棘突(spike，S)糖蛋白、小衣殼(envelope， E)糖蛋白、膜(membrane， M)糖蛋白和核衣殼(nucleocapsid，N)核蛋白，少數(shù)冠狀病毒還具有血凝素酯酶(hemagglutinin esterase，HE)糖蛋白。S糖蛋白主要負(fù)責(zé)CoV早期的宿主細胞黏附、紅細胞凝集和膜融合等，是CoV的主要抗原位點；E糖蛋白與CoV顆粒的形成和組裝有關(guān)；M糖蛋白主要負(fù)責(zé)CoV顆粒的組裝；N核蛋白位于病毒顆粒的核心部分，主要負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的復(fù)制等[19-20]。圖1為CoV的基因組結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1 冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 The structure diagram of CoV genome

CoV主要感染鳥類和哺乳類動物，可導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病。近年來，越來越多的研究顯示CoV也可感染人類，并在不同程度上引起腸道或呼吸道類疾病。CoV感染的潛伏期一般為2～5 d。典型的CoV感染呈流涕、不適等感冒癥狀。人冠狀病毒229E(huamn coronavirus 229E，HCoV-229E)、人冠狀病毒OC43(huamn coronavirus OC43，HCoV-OC43)、人冠狀病毒NL63(huamn coronavirus NL63，HCoV-NL63)和人冠狀病毒HKU1(huamn coronavirus HKU1，HCoV-HKU1)是4種可以感染人類，但一般不具高致病性的冠狀病毒[21-24]。

HCoV-229E和HCoV-OC43在20世紀(jì)60年代首次被發(fā)現(xiàn)，感染人類后均能引發(fā)普通感冒癥狀，并很少造成下呼吸道感染。HCoV-229E感染引發(fā)的感冒癥狀通常較輕微，主要表現(xiàn)為鼻部癥狀。HCoV-OC43感染后常伴有咳嗽、咽炎和鼻腔炎等[22]。HCoV-NL63是2004年從一名患有結(jié)膜炎和支氣管炎的7月齡嬰兒身上分離得到的，該病毒感染人類后，患者常表現(xiàn)出咳嗽、發(fā)熱和呼吸道感染等癥狀[23]。HCoV-HKU1是2005年從一名71歲的肺炎患者體內(nèi)分離得到的。該病毒感染人類后可造成輕度上呼吸道感染，癥狀包括發(fā)燒、咳嗽和鼻涕等。研究發(fā)現(xiàn)，老年人或帶有基礎(chǔ)疾病的患者感染HCoV-HKU1后，可能會出現(xiàn)嚴(yán)重肺炎甚至死亡。除此之外，HCoV-HKU1還可能導(dǎo)致兒童驚厥或胃腸道疾病[24]。截至目前為止，尚無針對上述4種CoV的有效疫苗。嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome corvonavirus，SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是兩種可以感染人類且具有高致病性的冠狀病毒。

2.1 SARS冠狀病毒

2.1.1 一般特征

SARS冠狀病毒(SARS-CoV)呈球形，直徑為80～120 nm，基因組全長約29.4 kb，編碼11種蛋白質(zhì)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 (ACE2)為其受體。2002年該病毒首先爆發(fā)于我國廣東地區(qū)，并迅速蔓延至加拿大、美國和越南等30多個國家，導(dǎo)致了SARS的爆發(fā)，感染9000余人，死亡近800人[25]。SARS是一種起病急、傳播快、死亡率高的傳染病，被傳染的病人多數(shù)都與患者有過直接或間接接觸，或生活在疫區(qū)內(nèi)。SARS臨床上表現(xiàn)為缺氧、紫紺、38 ℃以上高熱、呼吸加速或呼吸窘迫綜合征、氣促等，X片表現(xiàn)為肺部不同程度改變[26]。到目前為止，仍沒有臨床認(rèn)可的抗病毒藥物、疫苗或單克隆抗體來治療SARS。

2.1.2 SARS-CoV疫苗研究現(xiàn)狀

S糖蛋白是SARS-CoV的主要表面抗原成分，具有抗原決定簇，可以誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，因此SARS-CoV疫苗主要圍繞S糖蛋白進行研制[27]。目前在研的SARS-CoV疫苗主要包括滅活病毒疫苗、減毒病毒疫苗、病毒載體疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗等。表2為SARS-CoV疫苗的研究現(xiàn)狀。

(1)滅活病毒疫苗

滅活病毒疫苗主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，這種疫苗在制備時，首先需要對SARS-CoV進行大量培養(yǎng)，然后采用紫外線、福爾馬林或β-丙內(nèi)酯對其進行滅活[28]。滅活病毒疫苗的研制周期較短，且相對穩(wěn)定，甚至不需要冷藏，在疾病爆發(fā)或緊急狀態(tài)下便于運輸。但是由于需要對病毒進行大規(guī)模培養(yǎng)，因此這種疫苗對生產(chǎn)的安全性條件要求較高[29]。滅活病毒疫苗是最早進入臨床試驗的SARS-CoV疫苗[30]。

(2)減毒病毒疫苗

減毒病毒疫苗可誘導(dǎo)機體同時發(fā)生體液免疫和細胞免疫，在制備時，首先需要通過化學(xué)誘導(dǎo)或定點突變等方法，使SARS-CoV的基因組發(fā)生突變，造成毒性減弱但仍保留其S糖蛋白的免疫原性。由于該疫苗使用的是活體病毒，因此可在機體內(nèi)長時間起作用，進而誘導(dǎo)較強的免疫反應(yīng)。但是這種疫苗的保存和運輸條件要求較高。除此之外，由于減毒病毒疫苗保留了一定的毒性，因此對一些個體，例如免疫缺陷者而言，有可能會誘發(fā)嚴(yán)重疾病[31]。

(3)病毒載體疫苗

病毒載體疫苗是指以另一病毒(簡稱宿主病毒)作為載體，將SARS-CoV的S糖蛋白基因與N核蛋白基因重組到宿主病毒基因組中，使其可以表達S糖蛋白和N核蛋白，進而制成疫苗。此類疫苗可有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高效價的中和抗體。但是由于此類疫苗是以病毒為載體，因此機體易對宿主病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)[31]。

(4)亞單位疫苗

亞單位疫苗指通過提取SARS-CoV的S糖蛋白片段(包含14～762位的氨基酸)與N核蛋白制成的疫苗。此類疫苗可以避免產(chǎn)生許多無關(guān)抗原誘發(fā)的抗體，進而減少疫苗的副反應(yīng)和疫苗引起的相關(guān)疾病。但是其免疫原性較低，通常需要佐劑合用才能產(chǎn)生良好的免疫效果[32]。

(5)DNA疫苗

DNA疫苗是指將SARS-CoV的S糖蛋白與N核蛋白基因克隆至質(zhì)粒載體，并直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫的一種疫苗。該類疫苗制備簡單、安全性好，可同時誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫，并可在體內(nèi)持續(xù)表達。但是有研究發(fā)現(xiàn)，含有N核蛋白基因的DNA疫苗有可能會引起遲發(fā)型的超敏反應(yīng)，從而危害機體健康[33]。

表2 SARS-CoV疫苗研究現(xiàn)狀

2.2 MERS-CoV

2.2.1 一般特征

MERS-CoV最早于2012年9月在沙特被發(fā)現(xiàn)，早期因與SARS臨床癥狀相似得名“類SARS病毒”，是第6種已知可以感染人類的冠狀病毒，該病毒會引發(fā)嚴(yán)重的中東呼吸綜合征(MERS)。MERS-CoV輕度感染的患者多表現(xiàn)為低燒、干咳、流鼻涕、肌痛和喉痛等；嚴(yán)重者則逐漸發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征、多系統(tǒng)疾病，直至器官衰竭[44]。截至目前為止，全球累計確診的MERS-CoV感染病例為2494例，其中858例死亡，病死率約為34%。這些病例來自27個國家和地區(qū)，并多集中在沙特阿拉伯、阿聯(lián)酋等中東地區(qū)，該地區(qū)以外國家的確診病例發(fā)病前多有中東地區(qū)工作或旅游史[45]。

2.2.2 MERS-CoV疫苗研究現(xiàn)狀

MERS-CoV疫苗的研究狀況與SARS-CoV類似，也主要圍繞其S糖蛋白進行研制。目前有兩個MERS-CoV疫苗已在美國獲得臨床實驗批準(zhǔn)，分別是表達全長S糖蛋白的腺病毒疫苗(ChAdOx1)和DNA疫苗(GLS-5300)[46-47]。 除了結(jié)構(gòu)蛋白，MERS-CoV 還表達5種輔助蛋白。這些輔助蛋白雖然不參與MERS-CoV的基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，但是卻可幫助MERS-CoV逃避宿主的免疫反應(yīng)。因此這些輔助蛋白也可以作為抗原，用于產(chǎn)生抑制MERS-CoV活力的抗體[48]。

2.3 新型冠狀病毒

2.3.1 一般特征

2019-nCoV是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第7個可以感染人類的冠狀病毒，其基因組約29 891 bp，包括一個完整的ORF和兩端非翻譯區(qū)(untranslated regions, UTR)，編碼9860個氨基酸，G+C含量約38%[49]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV基因組有兩個核心位置具有高度變異性，分別是ORF1ab基因中的沉默變異和氨基酸ORF8中的多態(tài)性[50-51]。2019-nCoV 的S糖蛋白是一個三聚體結(jié)構(gòu)，每一個單體上都有細胞受體的結(jié)合位點。當(dāng)病毒與宿主細胞結(jié)合之后，這個三聚體會發(fā)生變構(gòu)，使病毒質(zhì)膜與宿主細胞膜發(fā)生融合，便于病毒侵入宿主細胞，從而進行擴增繁殖[52]。

2.3.2 2019-nCoV疫苗的研究現(xiàn)狀

此次新冠肺炎疫情從武漢爆發(fā)不久，2019-nCoV的全基因組即被準(zhǔn)確測序，并于2020年1月11日在網(wǎng)絡(luò)共享。在此基礎(chǔ)上，來自世界各地的研究團隊例如Vir生物技術(shù)公司、Morderna生物科技公司與美國國立衛(wèi)生研究院團隊、葛蘭素史克公司、俄羅斯衛(wèi)生部、昆士蘭大學(xué)、Novavax醫(yī)藥公司等均宣布開始新冠病毒的疫苗研發(fā)工作。與此同時，中國也有多個科研團隊投入疫苗研發(fā)當(dāng)中，包括中國疾病預(yù)防控制中心、香港大學(xué)袁國勇教授團隊、清華大學(xué)張琳琦教授團隊、浙江三葉草生物制藥公司團隊、上海東方醫(yī)院與斯微生物、北京艾棣維欣與Invio團隊、武漢博沃與GeoVax等公司合作團隊等。上述研發(fā)團隊采取的技術(shù)路線不同，其中張林琦教授團隊、武漢博沃與GeoVax團隊是通過腺病毒技術(shù)研發(fā)；北京艾棣維欣與Inovio團隊是通過DNA技術(shù)平臺研發(fā)；斯微生物與上海東方醫(yī)院合作團隊、Moderna與美國國立衛(wèi)生研究院合作團隊是通過mRNA技術(shù)平臺研發(fā)；浙江三葉草生物制藥公司團隊是通過其獨有的蛋白三聚體化專利和基因重組方法進行研發(fā)[53-56](見表3)。

表3 2019-nCoV的疫苗研究進展

3 2019-nCoV與其他病毒的相似性

雖然2019-nCoV是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，但是與本文所述其他病毒間仍存在一定的聯(lián)系，具體如表4所示[6, 49, 56]。

表4 2019-nCoV 與流感病毒、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV的主要相似性

基于上述多種相似性，我們在氨基酸水平上對2019-nCoV的S糖蛋白與A和B型流感病毒的HA糖蛋白進行了序列比對，如表5和圖2所示。比對結(jié)果顯示，2019-nCoV的S糖蛋白與流感病毒的HA糖蛋白之間具有一定的一致性。由于HA糖蛋白上具有抗原決定簇，可以刺激宿主機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進而生成相應(yīng)抗體[10]。因此基于氨基酸序列比對結(jié)果中存在的一致性，我們推測，2019-nCoV的S糖蛋白上可能也具有與HA糖蛋白相似的抗原決定簇。當(dāng)季節(jié)性商用流感病毒疫苗作用機體后，體內(nèi)產(chǎn)生的抗體在一定程度上也能識別2019-nCoV的S糖蛋白，并與其相互作用，阻斷S糖蛋白宿主細胞受體ACE2的結(jié)合。

由于在氨基酸水平上2019-nCoV 的S糖蛋白和N核蛋白與SARS-CoV也具有高度的相似性，而SARS-CoV疫苗又主要是在上述兩種蛋白的基礎(chǔ)上制備而來[56]，因此我們推測，機體經(jīng)SARS-CoV疫苗刺激后產(chǎn)生的抗體可能也會識別并作用2019-nCoV 的S糖蛋白與N核蛋白，進而干擾病毒顆粒對宿主細胞的入侵。

表5 2019-nCoV的S糖蛋白與流感病毒的HA糖蛋白的一致性

*表示序列一致；. 表示序列相似圖2 2019-nCoV的S糖蛋白與流感病毒的HA糖蛋白氨基酸水平序列比對結(jié)果Fig 2 The amino acid sequences comparison results between spike of 2019-nCoV and HA of Influenza virus

4 結(jié)論

為了分析現(xiàn)有病毒疫苗用于防治新冠肺炎的可行性，本文對流感病毒和7種冠狀病毒(HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV MERS-CoV和2019-nCoV)進行了綜述，并通過氨基酸水平的序列比對發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV的S糖蛋白與H1N1、H3N2、B型Victoria系和B型Yamagata系流感病毒的HA糖蛋白之間具有一定的相似性，2019-nCoV的 S糖蛋白和N核蛋白與SARS-CoV也具有高度的相似性?；诖耍覀兘ㄗh：

(1)在目前病毒爆發(fā)的態(tài)勢下，流感疫苗和實驗性SARS-CoV疫苗在2019-nCoV防控方面可能具有一定的應(yīng)用潛能。雖然就特異性而言，這些疫苗不是最理想的，但是由于商業(yè)流感疫苗的安全性已得到證實，且一些SARS-CoV疫苗已經(jīng)進入中國臨床試驗階段，因此可以考慮在短期內(nèi)將其作為2019-nCoV特效疫苗的替代物使用。

(2)可以考慮給2019-nCoV的高危易感人群，例如兒童、孕婦、老人以及長期奮戰(zhàn)在一線的醫(yī)務(wù)工作者們注射現(xiàn)有的季節(jié)性商用流感疫苗，從而提高他們自身的抗病毒能力。