鄭博 王寧 霍毅欣

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

自20 世紀(jì)60 年代首次實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸以來，微生物發(fā)酵技術(shù)憑借其成本低廉、工藝簡單和易于分離等特點，迅速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，增加多種氨基酸生產(chǎn)工藝，將氨基酸產(chǎn)品產(chǎn)值升至逾百億美金，涉及飼料添加劑、保健品和化妝品等多種行業(yè)［1］。目前，除蛋氨酸等個別氨基酸仍依賴于化學(xué)合成及酶催化以外，其余均可采用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)，不少廠商已開始通過轉(zhuǎn)向合成氨基酸衍生物等高附加值產(chǎn)品以緩解趨于飽和的氨基酸市場［2］。

高產(chǎn)穩(wěn)定的微生物菌株無疑是支撐大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的基本保障。然而，野生菌株通過精細(xì)的代謝調(diào)控機(jī)制以避免產(chǎn)生過多的氨基酸。最初研究人員通過篩選營養(yǎng)缺陷型菌株，成功獲得了可以積累鳥氨酸和賴氨酸的多種缺陷型菌株［3-4］。然而，營養(yǎng)缺陷型菌株并沒有真正意義上解除反饋機(jī)制，其應(yīng)用范圍也止步于此。1950 年有研究發(fā)現(xiàn)具有氨基酸類似物抗性的菌株同時具有向胞外分泌氨基酸的特性［5-6］，并于1970 年首次利用氨基酸類似物篩選出高產(chǎn)賴氨酸的菌株［7］。該方法的本質(zhì)是對胞內(nèi)翻譯過程的競爭性抑制（圖1）。這些類似物的結(jié)構(gòu)、分子量和電荷特性與組成蛋白質(zhì)的氨基酸十分相近，可以與對應(yīng)的氨基酸競爭數(shù)量有限的tRNA，卻無法參與肽鏈的延伸［8］。它們所結(jié)合的tRNA 比例越高，對蛋白質(zhì)正常翻譯的阻礙就越大，最終導(dǎo)致菌體生長減緩甚至死亡［9-10］。

圖1 氨基酸類似物篩選氨基酸高產(chǎn)菌株作用機(jī)理

因此，通過簡單正篩實驗，從突變菌中挑取能夠在高濃度氨基酸類似物條件下生長最快的菌落，即有可能獲得高產(chǎn)氨基酸的突變菌株。氨基酸類似物的篩選工作幾乎覆蓋了20 種天然氨基酸（表1），也涉及不同種屬的菌株，極大地推進(jìn)了微生物大規(guī)模生產(chǎn)氨基酸的工業(yè)化進(jìn)程。然而，高濃度的氨基酸類似物會干擾細(xì)胞代謝甚至影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)［11-12］，部分突變會賦予細(xì)胞隔離、外排甚至降解氨基酸類似物的能力［10，13］，從而擺脫篩選壓力。

目前，使用氨基酸類似物篩選氨基酸高產(chǎn)菌株的方法已經(jīng)貢獻(xiàn)出許多優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，但是對菌株產(chǎn)量提升的幅度越來越小。一方面是因為長期使用的類似物種類有限，導(dǎo)致從篩選菌株中獲得新突變的難度變大；另一方面是由于早期的生產(chǎn)菌株多是通過對隨機(jī)突變庫進(jìn)行多輪篩選得到，在提高氨基酸發(fā)酵產(chǎn)量的同時在菌株基因組中引入了不確定的突變，可能導(dǎo)致進(jìn)一步提高氨基酸積累的困難。近年來，氨基酸生物傳感器相關(guān)研究不斷產(chǎn)生突破。利用富含稀有密碼子的基因篩選氨基酸高產(chǎn)菌株的策略也被提出，提供了面向更加廣譜的微生物菌種的高效、準(zhǔn)確和簡便的篩選方法，利用該方法篩選獲得的菌株可以為微生物生產(chǎn)和積累氨基酸的研究提供更豐富的基因信息。

1 利用稀有密碼子篩選氨基酸高產(chǎn)菌株

在肽鏈合成過程中，密碼子可被對應(yīng)的氨酰tRNA 識別并翻譯成氨基酸。然而，不同密碼子對應(yīng)的tRNA 的相對豐度并不相同，翻譯高頻密碼子的tRNA 在胞內(nèi)的含量最為豐富，而翻譯稀有密碼子的tRNA 含量較低［26］。在同類tRNA 競爭游離氨基酸的過程中，含量豐富的tRNA 有更大的概率競爭到氨基酸并完成高頻密碼子的翻譯。因此，將異源蛋白編碼基因中的密碼子替換為宿主偏好的高頻密碼子可以顯著提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量，由此催生了“密碼子優(yōu)化”策略［27］。在氨基酸饑餓的情況下，稀有tRNA 在與其他tRNA 的競爭中難以捕獲到足夠的氨基酸，常處于“空載”狀態(tài)，難以完成稀有密碼子的翻譯。因此在氨基酸饑餓條件下，富含稀有密碼子的異源蛋白編碼基因的翻譯速率普遍緩慢，甚至無法進(jìn)行。只有當(dāng)胞內(nèi)氨基酸濃度大幅提升并使大部分tRNA 維持“滿載”時，稀有tRNA 才有機(jī)會捕獲到剩余的氨基酸［28］，富含稀有密碼子的基因才能正常表達(dá)。這些能夠在胞內(nèi)累積氨基酸的菌株即是所謂的氨基酸高產(chǎn)菌株（圖2）［29］。

表1 氨基酸類似物及其篩選結(jié)果

圖2 氨基酸饑餓條件下稀有密碼子數(shù)量與翻譯速率的關(guān)系

與氨基酸類似物競爭性地抑制翻譯過程相似，利用富含稀有密碼子的篩選標(biāo)記可以將翻譯過程與胞內(nèi)氨基酸濃度建立關(guān)聯(lián)，并在氨基酸饑餓的條件將差異進(jìn)一步的放大，最終通過生長和表型差異篩選氨基酸高產(chǎn)菌株。根據(jù)所用篩選標(biāo)記的不同，該方法可以分為選擇系統(tǒng)和篩選系統(tǒng)。前者使用抗生素抗性基因，表現(xiàn)為菌體的生長水平差異，后者使用顏色蛋白、熒光等表型基因，表現(xiàn)為菌體特征差異。在兩種篩選系統(tǒng)中，質(zhì)?？截悢?shù)和標(biāo)記基因的啟動子強(qiáng)度會影響菌體的生長。改變稀有密碼子的頻率，以及更換復(fù)制起始位點或啟動子可調(diào)節(jié)系統(tǒng)的選擇強(qiáng)度。實驗表明使用弱啟動子和拷貝數(shù)較低的復(fù)制起始位點更有助于提高系統(tǒng)的選擇或篩選能力。當(dāng)使用誘導(dǎo)型啟動子時，可設(shè)定不同的誘導(dǎo)劑量逐級改變啟動子強(qiáng)度，從而確定最佳的誘導(dǎo)水平。

突變不僅能夠賦予菌株高產(chǎn)某種氨基酸的特性，還有可能造成對抗生素的抗性，導(dǎo)致以抗生素抗性基因為篩選標(biāo)記的選擇系統(tǒng)中出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。以上假陽性現(xiàn)象可通過兩種途徑消除：其一是向選擇系統(tǒng)質(zhì)粒中插入gfp等顏色指示基因，存活于抗生素脅迫的菌株可通過熒光或顏色表型進(jìn)行復(fù)篩，以確保選擇系統(tǒng)功效的發(fā)揮；還可構(gòu)建含有兩種抗生素抗性基因的選擇系統(tǒng)以消除假陽性菌株。除富含稀有密碼子的抗性基因外，該質(zhì)粒系統(tǒng)上還插入了針對另外一種抗生素的野生型抗性基因。在誘變中獲得了一種抗生素抗性的菌株幾乎不可能同時獲得針對另一種抗生素的抗性。因此，任何存活于兩種抗生素脅迫條件下的菌株都應(yīng)含有篩選質(zhì)粒并具備更強(qiáng)的氨基酸合成能力。除常見的抗性基因外，sacB［30］、tolC［31］和ccdAB［32］等毒素-解毒系統(tǒng)也可用于選擇及篩選系統(tǒng)的構(gòu)建。當(dāng)采用這類基因時，可將解毒基因上的密碼子替換為其稀有形式。此時，只有能夠高產(chǎn)對應(yīng)氨基酸的菌株才可以維持解毒基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生足夠量的解毒蛋白使菌株得以生存。

以上高、低豐度tRNA 對胞內(nèi)游離氨基酸的競爭機(jī)制為氨基酸生物傳感器的設(shè)計提供了新思路。將基因中的密碼子替換為其稀有形式即可提高翻譯過程對氨基酸含量要求的“門檻值”，此時，蛋白的表達(dá)速率可反映胞內(nèi)氨基酸的濃度。通過將蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與菌體生長或顏色表型相偶聯(lián)，即可從菌株庫中快速鑒別出可能的氨基酸高產(chǎn)菌株。該策略對細(xì)胞結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)其他生化過程無負(fù)面影響，理論上可以克服氨基酸類似物篩選法的缺陷。

2 稀有密碼子篩選策略的應(yīng)用拓展

密碼子偏好性的發(fā)現(xiàn)及其延伸出的稀有密碼子的概念和密碼子優(yōu)化的技術(shù)方案，該方案解決了基因工程中異源蛋白表達(dá)困難的問題［27］。但是不斷有研究發(fā)現(xiàn)，稀有密碼子的作用不僅僅是限制mRNA的翻譯速率，它們在穩(wěn)定mRNA 二級結(jié)構(gòu)、調(diào)控肽鏈延伸速率和輔助蛋白折疊等方面也有非常重要的作用。替換某些必需基因中的稀有密碼子（如精氨酸稀有密碼子AGR）可能會影響序列結(jié)構(gòu)和翻譯起始，從而造成細(xì)胞死亡［33-35］。利用稀有密碼子造成的翻譯脅迫篩選氨基酸高產(chǎn)菌株方法，本質(zhì)上是在饑餓條件下多種tRNA 競爭氨基酸的過程，證明了增加稀有密碼子數(shù)量這一“密碼子負(fù)優(yōu)化”方式可以顯著減緩甚至終止mRNA 的翻譯。在某些基因（如dCas9）中增加稀有密碼子的數(shù)量，限制其在生長前期的表達(dá)量，在需要的時候通過補(bǔ)加氨基酸來調(diào)控特定基因的翻譯。這種類似誘導(dǎo)表達(dá)的模式具有調(diào)節(jié)精確，無泄露表達(dá)，不影響細(xì)胞正常生長等特點，且價格遠(yuǎn)低于常用誘導(dǎo)劑。

部分氨基酸的密碼子數(shù)量較少，細(xì)胞對這部分同義密碼子的使用頻率沒有明顯的差異，限制了該方法在此類氨基酸高產(chǎn)菌株篩選中的應(yīng)用。通過引入異源的tRNA 和氨酰tRNA 合成酶（Aminoacyl tRNA Synthetase，aaRS）正交對能夠針對性的解決以上問題。通常經(jīng)過篩選得到的tRNA 和aaRS 正交對相互識別，且獨立于宿主翻譯系統(tǒng)中的其它正交對，可以成功將非天然氨基酸插入到肽鏈中，實現(xiàn)蛋白質(zhì)功能的改造［36］。目前使用非天然氨基酸改造蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)較為成熟。利用終止密碼子等三聯(lián)體密碼子將非天然氨基酸插入肽鏈的策略可能干擾基因組其它基因的正常翻譯。一方面有研究通過人工修改基因組序列，構(gòu)建僅有63 種甚至61 種密碼子的大腸桿菌［37-38］；另一方面使用翻譯四聯(lián)體密碼子的tRNA 和aaRS 正交對，既能夠解決菌株中沒有稀有密碼子的問題，又可以避免干擾胞內(nèi)正常tRNA 的工作［39］。因此，通過改造tRNA 反密碼子環(huán)或者引入翻譯四聯(lián)體密碼子的tRNA 及其aaRS正交對，可以人為地在胞內(nèi)引入“稀有”密碼子及tRNA，從而實現(xiàn)對其余氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選。這一策略不僅可以為常用的生產(chǎn)菌株篩選出更多新的突變位點，更重要的是可以憑借密碼子的普適性，將篩選范圍拓展至具有多密碼子的氨基酸及所有微生物物種，為氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選提供了高效解決方案。

3 基于轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控胞內(nèi)氨基酸合成

微生物細(xì)胞通過不同層級的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實現(xiàn)基因功能的選擇性發(fā)揮，進(jìn)而將資源引導(dǎo)至不同的生命活動形式，而翻譯是轉(zhuǎn)錄的終點，是實施調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它允許細(xì)胞在mRNA 合成終止后對蛋白質(zhì)合成進(jìn)行再次干預(yù)，這對于延長發(fā)酵時間、增加底物利用率和目標(biāo)代謝物產(chǎn)量有重要意義。目前通過轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的強(qiáng)化，以分配合理化、功能多樣化及途徑最優(yōu)化等理念，成功構(gòu)建了用于生產(chǎn)生物燃料、糖醇和芳香族化合物等物質(zhì)的高產(chǎn)菌株［40］。基于轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的工程改造可針對翻譯速率與翻譯的持續(xù)性兩部分展開，直接影響了途徑酶的生成速率與總量［41-42］。

3.1 翻譯速率

許多目標(biāo)合成途徑包含異源基因，因缺少與之匹配的原生翻譯系統(tǒng)，異源基因在底盤宿主內(nèi)的表達(dá)常受到阻礙。即便對于宿主來源的基因，其表達(dá)產(chǎn)生蛋白的效率也往往難以達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)的要求。翻譯速率的優(yōu)化可以使細(xì)胞在單位時間內(nèi)產(chǎn)生更多的酶，從而由生長狀態(tài)快速投入至生產(chǎn)活動，也能使細(xì)胞工廠及時補(bǔ)充生產(chǎn)過程中酶的消耗，確保生產(chǎn)的持續(xù)進(jìn)行［43-44］。

翻譯速率的優(yōu)化可以從翻譯的起始和肽鏈的延伸兩個過程入手。前者依賴于對核糖體結(jié)合區(qū)域（RBS）（原核）或mRNA 的5'端帽（真核）的改造，旨在加強(qiáng)mRNA 招募核糖體的能力，提升核糖體起始翻譯的效率［9］。優(yōu)化后的RBS 可以使蛋白表達(dá)量提升數(shù)倍，進(jìn)一步驅(qū)動目標(biāo)化合物的生成［10］。調(diào)控肽鏈延伸的常用手段是密碼子優(yōu)化，它依據(jù)宿主的密碼子偏好性，將異源基因中的稀有密碼子替換為宿主常用的密碼子形式，使其更容易被宿主的tRNA讀取，從而將核酸信息快速翻譯為氨基酸序列。與原始基因相比，優(yōu)化后的基因在微生物宿主中的表達(dá)效率可提高100 倍以上［45］。此外，mRNA 中的二級結(jié)構(gòu)也會阻礙核糖體的移動并降低翻譯速率［46］，這一負(fù)面作用也可通過密碼子優(yōu)化消除［47］。

3.2 翻譯的持續(xù)性

作為翻譯的模板，mRNA 的穩(wěn)定性將直接影響翻譯過程的持續(xù)時間。穩(wěn)定的mRNA 可供翻譯系統(tǒng)反復(fù)使用，使細(xì)胞以最少的轉(zhuǎn)錄投入獲得預(yù)期的蛋白產(chǎn)量。該策略彌補(bǔ)了基因表達(dá)過程中轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的限制，可有效提升低拷貝途徑基因的表達(dá)水平［11］。一般可通過向mRNA 的5'或3'端引入發(fā)卡或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，保護(hù)片段不被RNA 酶降解［12-13］。

對轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的正向調(diào)控可以使微生物工廠合成目標(biāo)代謝物的能力得到提升，而對翻譯水平的負(fù)調(diào)控則為篩選氨基酸高產(chǎn)菌株提供了全新的思路［29，48］。參與蛋白質(zhì)合成的20 種氨基酸總共由61個密碼子編碼，除蛋氨酸和色氨酸外，每一種氨基酸至少對應(yīng)兩種以上的密碼子，其中精氨酸、亮氨酸和絲氨酸的同義密碼子數(shù)量可達(dá)6 個［49］。原核與真核生物均表現(xiàn)出對特定密碼子的使用偏好性，其中使用頻率較低的一類密碼子被稱為稀有密碼 子［50-51］。密碼子使用的偏好性因物種而異，一種生物的高頻密碼子可能是另一種生物的稀有密碼子［52］。這一偏好性會影響異源基因的翻譯起始［53］、肽鏈延伸［54］及蛋白折疊［55］等過程。

4 總結(jié)與展望

目前仍有一些氨基酸缺少能夠用于大規(guī)模生產(chǎn)的菌株。一方面由于傳統(tǒng)篩選方法的局限性，某些途徑特殊的氨基酸必須經(jīng)過多種類似物的輪流篩選，但產(chǎn)量難有顯著提升；另一方面是對高產(chǎn)菌株進(jìn)行進(jìn)一步基因編輯或整合多種優(yōu)勢突變時難度較大，缺乏對微生物細(xì)胞工廠理性設(shè)計及優(yōu)化的技術(shù)基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究僅對谷氨酸棒狀桿菌基因組進(jìn)行12 處編輯，其賴氨酸的產(chǎn)量提高至120 g/L［56］。因此，需要將全新的篩選方法應(yīng)用于多種氨基酸、不同菌種的篩選中，獲得更多的優(yōu)勢突變信息，為分析和構(gòu)建氨基酸高產(chǎn)菌株提供更多的基因信息；同時也利用簡易高效的基因編輯技術(shù)，整合多種優(yōu)勢突變信息于單一菌株中，從頭構(gòu)建可用于大規(guī)模生產(chǎn)的工業(yè)菌株，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平針對性設(shè)計優(yōu)化胞內(nèi)代謝流分配，最終將菌株的生產(chǎn)能力和效率提升到新的水平。