曹燕亭 劉延峰 李江華 劉龍 堵國(guó)成

（1. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122）

近年來(lái)，合成生物學(xué)飛速發(fā)展，設(shè)計(jì)與構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品成為化學(xué)品綠色生物制造的重要手段［1-4］。目前，研究人員已開(kāi)發(fā)出許多合成生物學(xué)工具和策略來(lái)提高微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度，如酶活性和表達(dá)水平的優(yōu)化、競(jìng)爭(zhēng)途徑的阻斷、中心代謝改造和基于合成遺傳回路的動(dòng)態(tài)調(diào)控等［4-6］。隨著生物合成的轉(zhuǎn)化率逐步接近理論的最大值，進(jìn)一步提升生物合成效率變得更加困難，因此亟需開(kāi)發(fā)新的工具和方法［7］。

隨著顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)等單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)同基因型的純培養(yǎng)微生物中單細(xì)胞間的生長(zhǎng)和代謝表現(xiàn)出異質(zhì)性，且存在不同的細(xì)胞亞群，即非生產(chǎn)、低產(chǎn)或高產(chǎn)細(xì)胞亞群同時(shí)存在［8-13］。高產(chǎn)細(xì)胞亞群由于引入的異源途徑會(huì)與細(xì)胞內(nèi)源過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)底物、核糖體、聚合酶等資源，其中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物、基因表達(dá)的蛋白等也可能對(duì)細(xì)胞有毒性而形成生產(chǎn)負(fù)擔(dān)，從而表現(xiàn)出降低的生長(zhǎng)適應(yīng)能力［14-17］。與此相反，低產(chǎn)細(xì)胞亞群和非生產(chǎn)亞群消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)卻不能高效合成目標(biāo)產(chǎn)物，它們可能將更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于細(xì)胞生長(zhǎng)，因而比高效合成目標(biāo)產(chǎn)物的高產(chǎn)細(xì)胞亞群更加具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在長(zhǎng)時(shí)間或者大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中，更加具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的低產(chǎn)細(xì)胞亞群和非生產(chǎn)亞群會(huì)逐漸取代高產(chǎn)細(xì)胞亞群，從而降低產(chǎn)物合成的綜合效率［18-19］。因此，細(xì)胞亞群調(diào)控有望成為提升生物合成效率的新途徑。

目前已發(fā)表綜述主要針對(duì)細(xì)胞亞群產(chǎn)生的機(jī)制、細(xì)胞亞群對(duì)生物合成的潛在影響、以及基于生物傳感器的細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成偶聯(lián)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的介紹和展望［7，20-23］，缺少關(guān)于細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)適用范圍受限和低產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸的討論和解決方法的提出。綜上，本文歸納總結(jié)了細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的常用方法，重點(diǎn)討論了目前細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)存在的問(wèn)題及其解決策略。

1 細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的常用方法

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，研究人員已經(jīng)利用合成遺傳回路開(kāi)發(fā)了細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)，這些系統(tǒng)結(jié)合“獎(jiǎng)勵(lì)-懲罰”規(guī)則，利用正向響應(yīng)產(chǎn)物濃度的生物傳感器調(diào)控抗生素抗性基因、氨基酸合成途徑關(guān)鍵基因和必需基因表達(dá)，將產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)起來(lái)，賦予高產(chǎn)細(xì)胞亞群生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，提高純培養(yǎng)物中高產(chǎn)細(xì)胞亞群所占的比例，從而改善了大腸桿菌中游離脂肪酸、酪氨酸和甲羥戊酸的合成［24-25］（圖1）。

Xiao 等［24］結(jié)合流式細(xì)胞儀分析了大腸桿菌中游離脂肪酸合成的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)在同基因型的生產(chǎn)游離脂肪酸的大腸桿菌群體中只有15%的細(xì)胞能高效合成游離脂肪酸，且這個(gè)亞群的游離脂肪酸總產(chǎn)量超過(guò)了整個(gè)群體總產(chǎn)量的50%?；谝陨戏治觯芯空邆冮_(kāi)發(fā)了一個(gè)利用基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的生物傳感器的群體質(zhì)量控制系統(tǒng)（PopQC）調(diào)控細(xì)胞亞群，并將游離脂肪酸的產(chǎn)量提高了3 倍。群體質(zhì)量控制系統(tǒng)包括一個(gè)基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FadR 的生物傳感器，該生物傳感器可以正向響應(yīng)游離脂肪酸濃度：在低產(chǎn)細(xì)胞或者非生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)adR 可以結(jié)合在啟動(dòng)子PAR上，抑制tetA基因表達(dá)；而在高產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)，高濃度目標(biāo)產(chǎn)物的存在可以解除FadR 對(duì)啟動(dòng)子PAR的阻遏，下游tetA基因連續(xù)表達(dá)。群體質(zhì)量控制系統(tǒng)通過(guò)這種方式偶聯(lián)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，從而賦予高產(chǎn)細(xì)胞亞群生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，提升生物合成效率。同樣的策略應(yīng)用于酪氨酸合成，致使酪氨酸產(chǎn)量提高了 2.6 倍［24］。

圖1 細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)與構(gòu)建的常用方法

由于抗生素的使用會(huì)提高生產(chǎn)成本，增加抗生素污染的機(jī)會(huì)等，因此一種可避免抗生素使用的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)［24］。該系統(tǒng)將生產(chǎn)菌株基因組上的leuABCD基因拷貝敲除后，在質(zhì)粒上用基于FadR 的生物傳感器調(diào)控亮氨酸合成途徑基因（leuABCD）的表達(dá)，導(dǎo)致低產(chǎn)細(xì)胞因亮氨酸合成不足而生長(zhǎng)受到抑制，高產(chǎn)細(xì)胞因?yàn)榭梢院铣筛嗟牧涟彼岫泳哂猩L(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用該細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)后，游離脂肪酸產(chǎn)量提升了5 倍。雖然該細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)能提升生物合成效率，且避免抗生素的使用，但是該系統(tǒng)在有效工作前需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑煲允咕瓿蔀榱涟彼崛毕菪?，且培養(yǎng)基中亮氨酸的存在也會(huì)導(dǎo)致亞群調(diào)控系統(tǒng)失效。

2018 年，Rugbjerga 等［25］利用胞內(nèi)必需過(guò)程，開(kāi)發(fā)了更加具有優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用生物傳感器調(diào)控必需基因表達(dá)，避免了抗生素的使用，又解決了培養(yǎng)基和宿主受限的問(wèn)題。在工業(yè)發(fā)酵后期，改造的細(xì)胞工廠合成能力常常降低或者完全喪失，一個(gè)重要原因是非生產(chǎn)細(xì)胞亞群存在［24，26-27］。因此，該系統(tǒng)利用正向響應(yīng)甲羥戊酸的生物傳感器調(diào)控必需基因的表達(dá)，從而來(lái)懲罰發(fā)酵過(guò)程中的非生產(chǎn)亞群。因?yàn)榭刂萍?xì)胞生長(zhǎng)可能會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)一些適應(yīng)成本［28-29］，這可能會(huì)降低生物合成效率，所以該系統(tǒng)在選擇必需過(guò)程時(shí)避開(kāi)了轉(zhuǎn)錄、翻譯和葡萄糖代謝等必需過(guò)程，并替換了調(diào)控必需基因的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），以優(yōu)化細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)。最終，改造的細(xì)胞工廠可以維持高產(chǎn)甲羥戊酸狀態(tài)直至細(xì)胞傳代95 次，而沒(méi)有進(jìn)行亞群調(diào)控的菌株在傳代50 次以后甲羥戊酸合成能力逐步喪失。

2 目前已開(kāi)發(fā)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)存在的 問(wèn)題

目前已開(kāi)發(fā)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)都是基于響應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的生物傳感器構(gòu)建的，因此只能應(yīng)用于有特異性響應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的生物傳感器存在的生物合成途徑。隨著合成生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多能夠響應(yīng)不同種類的小分子代謝物的蛋白質(zhì)或者RNA 元件（如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、核酸適配體等），響應(yīng)的小分子代謝物涵蓋氨基酸、糖磷酸酯、脂類和糖類等，且在此基礎(chǔ)之上，已成功開(kāi)發(fā)了許多不同的生物傳感器［30-33］，但是在實(shí)際應(yīng)用中，仍然存在缺少天然響應(yīng)或者特異性響應(yīng)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的生物傳感器的問(wèn)題［34-35］，這嚴(yán)重限制了細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的可擴(kuò)展性。除此之外，目前的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)都是利用生物傳感器直接感知目標(biāo)產(chǎn)物濃度的變化，利用合成遺傳回路富集高產(chǎn)細(xì)胞亞群，應(yīng)用于不同目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成時(shí)需要構(gòu)建不同的生物傳感器，增加了細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)用的復(fù) 雜性。

自發(fā)突變和負(fù)擔(dān)是限制很多改造的細(xì)胞工廠應(yīng)用的主要因素［17］。目前已開(kāi)發(fā)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)利用基于正向響應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的生物傳感器控制細(xì)胞生長(zhǎng)，這可能會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)一些生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)，增加細(xì)胞的適應(yīng)成本［28-29］，從而降低生物合成效率。在基于生物傳感器調(diào)控抗生素抗性基因和必需基因表達(dá)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中，研究者們采用抗生素濃度和添加時(shí)間優(yōu)化、調(diào)控必需基因表達(dá)的啟動(dòng)子和RBS 替換優(yōu)化細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)。優(yōu)化后的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)可以使低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)受到抑制，而高產(chǎn)或者生產(chǎn)細(xì)胞亞群能維持與野生型細(xì)胞幾乎一致的生長(zhǎng)［24-25］，一方面減少了因off 狀態(tài)的泄露導(dǎo)致的低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸；另一方面避免引入細(xì)胞亞群調(diào)控形成負(fù)擔(dān)而降低生物合成效率。但是上述研究未充分考慮到可遺傳突變對(duì)細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的影響。由于同源重組、非同源重組、轉(zhuǎn)座元件、質(zhì)粒不穩(wěn)定和胞內(nèi)外環(huán)境壓力等因素存在，不論是經(jīng)過(guò)改造的工程菌還是未經(jīng)改造的野生型菌株都以10-2-10-10/bp/代的突變速率經(jīng)歷著持續(xù)進(jìn)化［17］。而在細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中，生物傳感器部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子因自身突變或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)突變而不能結(jié)合到其調(diào)控的啟動(dòng)子上，或者調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)的啟動(dòng)子因突變而不能有效轉(zhuǎn)錄（圖2）等均可能引起細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中調(diào)控生長(zhǎng)的基因持續(xù)表達(dá)，造成非生產(chǎn)細(xì)胞亞群或者低產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸。逃逸的低產(chǎn)細(xì)胞亞群在發(fā)酵過(guò)程中逐步取代因高產(chǎn)失去一定生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的高產(chǎn)細(xì)胞亞群，從而使細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)失效。因此，細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)很有可能因可遺傳突變引起低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸而失效。

圖2 可遺傳突變引起細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)失效

3 目前已開(kāi)發(fā)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)存在問(wèn)題的解決策略

目前已開(kāi)發(fā)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)依賴于生物傳感器，其使用受到可用的生物傳感器限制，因此擴(kuò)展生物傳感器的特異性可以擴(kuò)展細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)到更多的生物合成途徑。結(jié)合化學(xué)信息學(xué)分析、基于轉(zhuǎn)錄組的生物信息學(xué)分析等，目前已成功鑒定響應(yīng)多種人們高度感興趣的目標(biāo)代謝產(chǎn)物的蛋白質(zhì)元件，如內(nèi)酰胺［36］、苯丙氨酸［37］和正丁醇［38］等，以及它們調(diào)控的啟動(dòng)子，且在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了不同的生物傳感器。除了基于蛋白質(zhì)元件之外的生物傳感器，目前也有一些基于RNA 元件的生物傳感器，這類傳感器因不需要翻譯成蛋白質(zhì)，給細(xì)胞造成的負(fù)擔(dān)小而備受關(guān)注。經(jīng)典的SELEX［30］、最近開(kāi)發(fā)的RNA Capture-SELEX［39］、結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)的染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP-Seq）以及一種原核生物和真核生物均適用的基因組范圍內(nèi)鑒定天然RNA 適配體的方法（PARCEL）［40］等都可用于篩選鑒定新的響應(yīng)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的RNA 元件，進(jìn)一步擴(kuò)展生物傳感器的特異性。在實(shí)際應(yīng)用中，天然響應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的RNA 或者蛋白質(zhì)元件不一定存在。因此，改造已存在的生物傳感器的特異性不失為一種有效方法。目前已有綜述討論了如何利用隨機(jī)突變、結(jié)構(gòu)域組裝、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等技術(shù)改變已存在的生物傳感器的特異性，擴(kuò)展其應(yīng)用范圍［34，41］，所以這里將不再贅述。除了開(kāi)發(fā)響應(yīng)小分子代謝物的生物傳感器，目前已有感知胞內(nèi)負(fù)擔(dān)［42-43］或者代謝通量變化［44］等而非特定目標(biāo)代謝物的生物傳感器，基于此設(shè)計(jì)合理的遺傳回路，也許可以富集低負(fù)擔(dān)或者低耗細(xì)胞亞群，從而提升產(chǎn)物合成的綜合效率；且這類合成遺傳回路在應(yīng)用于不同目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成時(shí)，可能不需要構(gòu)建不同的生物傳感器，從而簡(jiǎn)化細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的擴(kuò)展應(yīng)用。但基于這類傳感器的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)的效果還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)中，由于自發(fā)突變存在，細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)很有可能因可遺傳突變引起低產(chǎn)或者非生產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸而失效。目前已有綜述總結(jié)了通用的降低宿主自發(fā)突變率，增加改造的細(xì)胞工廠的遺傳穩(wěn)定性的策略，如敲除用于轉(zhuǎn)座的插入序列、敲除或者替換低保真性的DNA 聚合酶編碼基因和敲除與同源重組相關(guān)的基因，避免使用短的重復(fù)序列和高度相似的序列等［17］。因此，本文重點(diǎn)關(guān)注如何重構(gòu)和優(yōu)化細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)減少低產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸?？赡苡行p少低產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸的策略包括增加響應(yīng)靶信號(hào)的蛋白質(zhì)或者RNA 元件的拷貝數(shù)［45］、串聯(lián)增加這些響應(yīng)元件的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和構(gòu)建單輸入多輸出遺傳回路［46］等。當(dāng)增加生物傳感器部分能響應(yīng)靶信號(hào)元件的拷貝數(shù)或者這些響應(yīng)元件的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)時(shí)，其中一個(gè)拷貝或者一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)突變后還有其它的可發(fā)揮作用；用生物傳感器以單順?lè)醋有问秸{(diào)控兩個(gè)或者多個(gè)不同的控制生長(zhǎng)的基因的表達(dá)，形成單輸入多輸出遺傳回路，這時(shí)只有調(diào)控生長(zhǎng)的基因前的啟動(dòng)子都發(fā)生突變，低產(chǎn)細(xì)胞亞群或者非生產(chǎn)細(xì)胞亞群才會(huì)逃逸。

4 總結(jié)與展望

單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展幫助揭示了細(xì)胞亞群的存在，低產(chǎn)細(xì)胞亞群和非生產(chǎn)細(xì)胞亞群會(huì)降低產(chǎn)物合成的綜合效率。細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)結(jié)合“獎(jiǎng)勵(lì)-懲罰”規(guī)則，利用正向響應(yīng)產(chǎn)物濃度的生物傳感器將產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)起來(lái)，賦予高產(chǎn)細(xì)胞亞群生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，有效提升了生物合成效率。

基于響應(yīng)不同目標(biāo)代謝物的新型生物傳感器構(gòu)建的細(xì)胞亞群調(diào)控應(yīng)用范圍拓展，基于感知胞內(nèi)負(fù)擔(dān)或者代謝通量變化等富集低負(fù)擔(dān)或者低耗細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)與構(gòu)建將會(huì)成為細(xì)胞亞群調(diào)控的新趨勢(shì)。另外，降低宿主的可遺傳突變率、重構(gòu)和優(yōu)化亞群調(diào)控系統(tǒng)以減少低產(chǎn)細(xì)胞亞群或者非生產(chǎn)細(xì)胞亞群逃逸，有利于細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)高效提升生物合成效率。綜上，作為細(xì)胞代謝調(diào)控新工具的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)將受到越來(lái)越多的關(guān)注，設(shè)計(jì)構(gòu)建更優(yōu)的細(xì)胞亞群調(diào)控系統(tǒng)將成為新的發(fā)展趨勢(shì)。