孟麗娜 彭春瑩 李鐵棟 李博生，2

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所，北京 100083）

螺旋藻（Spirulina）是一種光合自養(yǎng)原核浮游植物［1］，能夠產(chǎn)業(yè)化的藻種營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白含量高達(dá)60%-70%［2］，還含有其他多種活性物質(zhì)，用途十分廣泛，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦為“21 世紀(jì)最佳食品”［3］。當(dāng)養(yǎng)殖條件適宜，螺旋藻生長(zhǎng)十分迅速，產(chǎn)量高。然而，螺旋藻粉質(zhì)量要求嚴(yán)格，其中重金屬含量是質(zhì)量檢測(cè)的重要方面，藻粉砷含量是其中指標(biāo)之一。螺旋藻細(xì)胞本身具有吸收和積累重金屬的特性［4-5］，易在養(yǎng)殖過(guò)程中造成砷積累，造成藻粉砷含量升高或超標(biāo)，導(dǎo)致藻粉質(zhì)量下降。王志忠等［6］研究表明藻粉中砷含量與養(yǎng)殖用水砷含量呈正相關(guān)；Guo 等［7］和Uppal 等［8］及王淑［9］研究表明砷在螺旋藻細(xì)胞內(nèi)主要通過(guò)砷的吸收、還原或氧化和甲基化過(guò)程進(jìn)行砷解毒；盡管穆文靜［10］和烏達(dá)巴拉［11］研究了砷（AsⅢ）脅迫下螺旋藻光合色素、藻藍(lán)蛋白、抗氧化酶活性的變化，表明砷對(duì)螺旋藻物質(zhì)代謝有影響，但迄今為止，在生理指標(biāo)變化研究的基礎(chǔ)上，關(guān)于砷對(duì)螺旋藻分子水平的影響并未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)螺旋藻砷脅迫的蛋白組學(xué)水平展開(kāi)研究，以在蛋白組水平上探索螺旋藻細(xì)胞對(duì)砷脅迫的應(yīng)對(duì)機(jī)制，為在螺旋藻養(yǎng)殖過(guò)程中調(diào)控砷吸收和積累提供理論依據(jù)和實(shí)際應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用藻種為北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所提供的鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatensissp.）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻培養(yǎng)條件 采用Zarrouk 培養(yǎng)基于28℃，光照強(qiáng)度60 μmol· m-2·s-1，搖床100 r/min培養(yǎng)，光照周期12 h∶12 h。

1.2.2 螺旋藻砷離子脅迫培養(yǎng) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種分別接種于不同濃度（0 ppm、1 ppm和2 ppm）的100 mL 含砷培養(yǎng)液中，于28℃，光照60 μmol· m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h，搖床100 r/min下培養(yǎng)。

1.2.3 光合放氧測(cè)定 取經(jīng)過(guò)砷離子脅迫10 min 后的藻液，控制測(cè)定溫度31℃，光強(qiáng)60 μmol· m-2·s-1，使用Chlorolab-2 液相氧電極（Hansatech Ltd.，UK）測(cè)定各組藻液的光合放氧速率，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.2.4 紫外-可見(jiàn)吸收光譜全波段掃描 收集24 h培養(yǎng)后的藻泥，蒸餾水沖洗至pH 值7 左右，凍干。取0.04g凍干藻粉于試管中，加入5 mL PBS 磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 值7.0），攪勻，溶脹4h后超聲震蕩10 min（冰水?。?，離心（6 000 r/min，4℃，15 min），收集離心上清液定容至10 mL，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行200-800 nm 全波長(zhǎng)掃描。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.2.5 SDS-PAGE 電泳 取培養(yǎng)7d后經(jīng)過(guò)凍干的螺旋藻樣品，在液氮中磨碎，加入25 mL 10%的三氯乙酸丙酮溶液和65 mmol/L DTT，-20℃沉淀1 h，10 000 r/min 離心45 min，取沉淀。向沉淀中加入25 mL 無(wú)水丙酮溶液，再次靜止沉淀、離心。離心沉淀干燥后在-80℃下保存。取干燥蛋白樣品40 μg，以上樣比例5∶1（V/V）加入6×上樣緩沖液，沸水浴反應(yīng)5 min，14 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行12.5% 的SDS-PAGE 電泳。電泳條件為：恒流：14 mA，電泳時(shí)間90 min。使用考馬斯亮藍(lán)來(lái)染色，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次，以獲得穩(wěn)定的差異蛋白圖譜。

1.2.6 質(zhì)譜樣品的制備 將存在顯著差異的蛋白質(zhì)條帶從整張凝膠圖譜中取出，放入裝有1 mL 水的離心管內(nèi)，清洗10 min，除去水后重復(fù)此操作一次。向樣品中加入1 mL 酶內(nèi)消化脫色液（50%乙腈，25 mmol/L 碳酸氫銨）清洗10 min，除去脫色液，重復(fù)此操作一次。向離心管中加入乙腈至樣品完全變白，真空抽去乙腈后加入10 mmol/L DTT，56℃水浴鍋內(nèi)孵育1 h。移除DTT 后加入55 mmol/L IAM，室溫下于暗室孵育45 min。移除IAM 后加入25 mmol/L碳酸氫銨清洗10 min，除去碳酸氫銨加入脫色液清洗10 min，重復(fù)清洗一次。加入乙腈脫水至樣品完全變白，真空抽去乙腈。用25 mmol/L 碳酸氫銨將1 μg/L 的酶儲(chǔ)液稀釋15 倍后加入樣品中，使樣品充分吸收，繼續(xù)加入25 mmol/L 碳酸氫銨沒(méi)過(guò)樣品，37℃水浴過(guò)夜。過(guò)夜后向樣品中加入終濃度為0.1%的TFA 終止消化。取10 μL 樣品上質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.2.7 質(zhì)譜分析 使用的液相系統(tǒng)為ultimate3000 納升液相，流動(dòng)相分別為A：0.1% FA 水溶液和B：0.1% FA 乙腈。樣品在2 μL/min 流速下通100% A相完成上樣，在ChromXP C18 預(yù)柱上（360 μm×0.5 mm，3 μm，C18-CL，120 A）富集，之后在0.4 μL/min 的流速下，通過(guò)一個(gè)65 min 的梯度在AcclaimTMPepMapTM100 C18 液相色譜柱（75 μm×2 cm，3 μm-C18）上分離。使用的梯度為：0-40 min，B 相由0線性升至30%；40-48 min，B 相由30%線性升至100%；48-65 minB相保持為100%。經(jīng)過(guò)液相分離后的肽段進(jìn)入Q Exactive 質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.2.8 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 使用MASCOT 引擎（2.2 版本）建立了螺旋藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合UniProt（Release-201707）微藻蛋白庫(kù)進(jìn)行綜合比對(duì)。質(zhì)譜定量到的蛋白質(zhì)以3 次對(duì)的生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)結(jié)果的平均值作為基礎(chǔ)，以Ratio＞1.2 且Pvalue＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白，查庫(kù)搜索MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)肽段。

1.2.9 生物信息學(xué)分析 利用Blast2GO（Version 2.7.2）鑒定所獲得的差異蛋白，對(duì)定量到蛋白的比對(duì)序列行使代謝途徑追蹤功能，分別提取與其所有關(guān)聯(lián)的GO 功能條目。用GO 注釋進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能分析，根據(jù)其生物學(xué)過(guò)程、分子功能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG 通路注釋。

2 結(jié)果

2.1 砷離子對(duì)螺旋藻光合放氧速率的影響

由圖1 可以看出，螺旋藻受到外液1 ppm 砷離子脅迫時(shí)，與對(duì)照相比光合放氧速率就出現(xiàn)明顯降低，光合放氧速率下降了21.2%；當(dāng)其砷離子濃度增加為2 ppm 時(shí)，光合放氧速率下降了27.7%，但兩者濃度之間差異并不大。

圖1 砷離子濃度對(duì)藻細(xì)胞光合放氧速率的影響

2.2 砷離子對(duì)螺旋藻細(xì)胞主要物質(zhì)的影響

由紫外-可見(jiàn)吸收光譜（圖2）可以看出，處理組與對(duì)照組特征峰趨勢(shì)一致，但砷處理組特征峰明顯低于對(duì)照。在200-800 nm 紫外-可見(jiàn)光范圍共有3 個(gè)吸收光譜帶200-400 nm，400-500 nm 和600-800 nm。在200-400 nm 的特征吸收峰位于254 nm；400-500 nm 紫外-可見(jiàn)光范圍有3 個(gè)吸收峰，吸收峰波長(zhǎng)分別是440 nm、490 nm 和500 nm；600-800 nm 紫外-可見(jiàn)光范圍內(nèi)分別出現(xiàn)620 nm、680 nm 吸收峰。

2.3 砷脅迫螺旋藻蛋白質(zhì)的SDS-PAGE

圖2 砷離子脅迫下螺旋藻提取液紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

由凝膠電泳（圖3）可以看出，與對(duì)照樣品相比，經(jīng)過(guò)2 ppm 砷離子處理后的樣品蛋白質(zhì)分子段在30 kD-55 kD 和70 kD-90 kD 范圍內(nèi)存在極顯著的差異，蛋白條帶顏色較深且密集。可見(jiàn)砷離子濃度增加到2 ppm，蛋白條帶變化更為顯著，且主要差異蛋白集中在上述兩個(gè)分子量范圍內(nèi)。因此，選擇2 ppm 砷脅迫差異蛋白條帶進(jìn)行后續(xù)分析。

圖3 不同濃度砷離子處理的螺旋藻蛋白電泳圖譜

2.4 差異表達(dá)蛋白的鑒定和功能分類(lèi)

采用質(zhì)譜分析和Mascot 查庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析，以PFD ≤0.01 過(guò)濾篩選后去除反相數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，得到唯一肽段的數(shù)目為5 783，蛋白質(zhì)組數(shù)目為721，3 個(gè)通道皆有定量信息的蛋白質(zhì)組數(shù)是596個(gè)，其中上調(diào)蛋白為28 個(gè)，下調(diào)蛋白47 個(gè)（P＜0.05） （表1）。

GO 功能分析表明，這些差異蛋白參與的細(xì)胞組成主要有功能酶活性（47.6%），結(jié)合（38.1%）以及氧化還原酶活性（7.6%）（圖4）；生物過(guò)程主要包括生物合成過(guò)程（46.2%），代謝過(guò)程（23.1%），光合過(guò)程（7.7%）與運(yùn)輸過(guò)程（7.7%）（圖5）。

圖4 差異性蛋白GO 功能注釋統(tǒng)計(jì)（分子功能）

圖5 白GO 功能注釋統(tǒng)計(jì)（生物過(guò)程）

KEGG 通路注釋分析表明，差異蛋白主要涉及光合作用、硝酸鹽代謝、氧化磷酸化、氨基酸的從頭代謝和氮代謝等信號(hào)/代謝通路。

根據(jù)GO 功能注釋結(jié)果，按參與生物代謝過(guò)程，這些差異蛋白主要可以分成5 大類(lèi)：能量代謝（33.3%），蛋白質(zhì)合成與折疊（8%），活性氧清除與防御（8%），離子運(yùn)輸和膜轉(zhuǎn)運(yùn)（6%），以及氨基酸合成（17.4%）（表1）。

3 討論

3.1 砷離子對(duì)螺旋藻光合放氧及其細(xì)胞內(nèi)容物的影響

螺旋藻光合作用是決定其生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要生理過(guò)程，砷離子濃度較低時(shí)（1 ppm-2 ppm），螺旋藻光合放氧速率就會(huì)受到顯著的抑制。砷含量小于1 ppm 是飼料級(jí)螺旋藻粉的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，控制砷離子濃度，對(duì)防止螺旋藻粉砷超標(biāo)及其穩(wěn)產(chǎn)都具有重要意義。

砷離子在較低濃度時(shí)就影響了螺旋藻的光合作用進(jìn)程，也一定會(huì)影響螺旋藻活性物質(zhì)的代謝。圖2 結(jié)果表明，砷離子明顯抑制了螺旋藻細(xì)胞的物質(zhì)積累。254 nm 為金屬硫蛋白的吸收峰［12］，金屬硫蛋白是細(xì)胞內(nèi)金屬結(jié)合蛋白的總稱(chēng)，可以被包括砷在內(nèi)的許多離子和化合物誘導(dǎo)，使細(xì)胞對(duì)重金屬的毒害有一定的抗性［13-14］，金屬硫蛋白相對(duì)含量的下降表明砷離子抑制了其在螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的積累且增加了其消耗。400-500 nm 一般為葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素吸收峰［15-18］。620 nm 與680 nm 分別為藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的特征吸收峰［19］。葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素通常與蛋白質(zhì)結(jié)合成色素蛋白，構(gòu)成螺旋藻的天線色素蛋白［20］，藻膽蛋白更是螺旋藻重要的捕光色素蛋白［21］。幾種捕光色素蛋白的降低，表明螺旋藻光合作用可能受到嚴(yán)重影響。穆文靜等［10］研究也表明砷離子（AsⅢ）會(huì)導(dǎo)致螺旋藻葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素以及藻膽蛋白含量的降低。光合速率降低，抗氧化作用啟動(dòng)，一定引起藻生理作用的改變。

3.2 螺旋藻砷脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)

3.2.1 能量代謝與光合作用相關(guān)蛋白 砷脅迫使ATP 合酶β 亞基（ATP synthase subunit beta）的數(shù)量下調(diào)，表明螺旋藻在砷脅迫下能量供應(yīng)系統(tǒng)可能受到了影響。Pandey 等［22］發(fā)現(xiàn)在40 mmol/L As（Na2HAsO4·7H2O）處理下。魚(yú)腥藻中該酶數(shù)量也呈下調(diào)趨勢(shì)。同樣的結(jié)果也在杜氏鹽藻［23］中出現(xiàn)。光合系統(tǒng)對(duì)于不同金屬污染物的損傷十分敏感。在呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)的蛋白中也可以發(fā)現(xiàn)。藻細(xì)胞的光合作用受到了顯著的影響。與光合作用、氧化磷酸化以及電子傳遞相關(guān)的蛋白均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。鎂原卟啉IX 螯合酶（Mg-protoporphyrin IX chelatase）作為合成葉綠素的重要酶呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)性表達(dá)，這種酶是參與卟啉和葉綠素代謝的最重要的酶之一［24-25］；光系統(tǒng)Ⅰ P700 葉綠素a 載脂蛋白A2（PhotosystemIP700 chlorophyllaapoprotein A2） 也呈現(xiàn)顯著性的下調(diào)表達(dá)，兩種葉綠素相關(guān)蛋白的下調(diào)標(biāo)志著葉綠素合成減緩或分解加速［26］。葉綠素作為電子傳遞鏈中吸收光子并傳遞電子的組分［27］，其分解影響了電子傳遞，從而抑制光合作用。同時(shí)，作為電子傳遞鏈中最大最復(fù)雜的一種酶NAD（P）H-醌氧化還原酶亞基H（NAD（P）H-quinone oxidoreductase subunit H），其下調(diào)也會(huì)影響電子傳遞過(guò)程，導(dǎo)致氧原子積累、葉綠素降解，從而影響光合作用［28］。

表1 砷離子脅迫下螺旋藻細(xì)胞差異表達(dá)蛋白

表1 續(xù)表

絲氨酸/蘇氨酸激酶（Serine/Threonine protein kinase with FHA domain modulation）、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶（Succinyldiaminopimelate transaminase）等蛋白的降低，表明光合作用產(chǎn)生能量的過(guò)程受到影響時(shí)，螺旋藻細(xì)胞無(wú)法通過(guò)氧化磷酸化的過(guò)程進(jìn)行能量補(bǔ)充。乙酰輔酶A 合成酶（AcetylcoenzymeAsynthetase）的下調(diào)直接影響了乙酰輔酶（Acetyl-CoA）的合成，乙酰輔酶的主要作用是將乙?；鶄鬟f給TCA，使其被氧化從而產(chǎn)生能量。碳酸脫水酶（Carbonate dehydratase，CA），又稱(chēng)carbonic anhydrase［29］，能夠促進(jìn)CO2在藻細(xì)胞中的固定［30］，對(duì)維持水溶CO2從質(zhì)膜到Rubisco 位點(diǎn)的穩(wěn)定流量，避免CO2從胞內(nèi)CO2庫(kù)向外流失起關(guān)鍵作用［31］。CA 數(shù)量的下調(diào)表明螺旋藻胞外固定CO2的能力已被抑制。另外，磷酸核酮糖激酶（Phosphoribulokinase，Prk）作為卡爾文循環(huán)最后一步的催化酶同樣被抑制，表明砷損害了螺旋藻對(duì)CO2的固定。Ge 等［23］發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻在11.2 mg/L As（Ⅴ）處理下，CA 與Prk均下調(diào)，其CO2固定過(guò)程也被抑制。

3.2.2 蛋白質(zhì)合成與折疊相關(guān)蛋白 由于光合作用的降低，導(dǎo)致ATP 和NADPH 無(wú)法正常合成，故而，依賴(lài)ATP 和NADPH 進(jìn)行的跨膜運(yùn)動(dòng)、酶促反應(yīng)和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成受到了不同程度的影響。包括硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白鐵氧蛋白亞硝酸合酶（Ferredoxin-nitrite reductase）的降低，直接導(dǎo)致藻細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液中氮源吸收的降低，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成［32-35］。同時(shí)，與氨基酸、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的下調(diào)，如苯丙氨酸t(yī)RNA 連接酶β 亞基（Phenylalanine-tRNA ligase beta subunit），也表明了蛋白質(zhì)合成過(guò)程的受阻。

ClpP 是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶［36-37］，完整的Clp 蛋白酶復(fù)合物具有一個(gè)桶裝結(jié)構(gòu)，其中ClpX 是夾在其中的具有ATPase 活性的子單元［38］。這些ClpX 可用于識(shí)別、展開(kāi)并將蛋白質(zhì)底物轉(zhuǎn)移到核心位置的功能［39］。在本研究中，ClpX 的降低大大影響了Clp 蛋白酶與底物結(jié)合的效率，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受損。

砷會(huì)干擾蛋白質(zhì)的折疊，造成蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集［40］。雖然螺旋藻蛋白質(zhì)合成過(guò)程受阻，但在砷脅迫下，一些伴侶分子蛋白呈現(xiàn)上調(diào)。這說(shuō)明藻細(xì)胞雖無(wú)法完全抵抗砷離子帶來(lái)的傷害，但其細(xì)胞內(nèi)部依然對(duì)砷離子的影響作出了明顯的響應(yīng)，重點(diǎn)保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。33 kD 伴侶蛋白（33 kD chaperonin）主要涉及蛋白質(zhì)的折疊，此伴侶蛋白幫助組蛋白折疊形成核小體，它涉及了將折疊的子單元組裝成寡聚結(jié)構(gòu)［41-42］。并且這類(lèi)蛋白的一個(gè)主要功能是放置新合成的多肽鏈和聚集的亞單位聚合成非功能區(qū)域［43］，同時(shí)為合成功能性區(qū)域保留必需的能量來(lái)源，這種伴侶蛋白的顯著上調(diào)在能量供給不足的情況下顯得尤為重要。延長(zhǎng)因子T（Elongation factor T）主要行使分子伴侶蛋白功能，此蛋白上調(diào)可保護(hù)其他蛋白免于聚集和降解。Anabaenasp. PPC 7120 在砷處理后也出現(xiàn)了相同的結(jié)果［22］。核糖體結(jié)合分子伴侶（Trigger factor）能與新生多肽鏈結(jié)合，是幫助新合成蛋白折疊的主要伴侶蛋白［44］，此類(lèi)蛋白的上調(diào)也是螺旋藻為保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)砷脅迫作出的響應(yīng)。

有3 個(gè)核糖體蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯的變化，其中兩個(gè)上調(diào)一個(gè)下調(diào)。然而，這些蛋白在砷代謝中的功能還需要進(jìn)一步研究。

3.2.3 活性氧清除與防御相關(guān)蛋白 砷酸鹽會(huì)引發(fā)細(xì)胞過(guò)氧化，對(duì)DNA、脂質(zhì)以及蛋白等大分子物質(zhì)造成氧化損傷［45］。砷處理下螺旋藻細(xì)胞中與氧化應(yīng)激相關(guān)的某些蛋白出現(xiàn)上調(diào)，包括谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthetase，GSH），氧化還原酶結(jié)構(gòu)域蛋白（Oxidoreductase domain protein），醛酮還原酶（Aldo/keto reductase）。

目前已確定谷胱甘肽（GSH）是植物防御系統(tǒng)抵御各種脅迫的核心組成部分之一［46］，GSH 通過(guò)捕獲自由基和催化還原過(guò)氧化氫來(lái)保護(hù)細(xì)胞［47-48］。螺旋藻內(nèi)GSH 的上調(diào)表明其對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化損傷作出積極應(yīng)答，此結(jié)果與杜氏鹽藻砷脅迫結(jié)果相同。當(dāng)杜氏鹽藻暴露于砷溶液時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的GSH 合成，在砷積累過(guò)程中作用顯著［49-50］。重金屬會(huì)引起細(xì)胞的強(qiáng)烈脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生多種醛類(lèi)物質(zhì)。Aldo/keto reductase（醛酮還原酶）在生物體內(nèi)能將多種有毒醛還原為毒性較小或沒(méi)有毒性的相應(yīng)醇類(lèi)物質(zhì)，是有毒醛的一個(gè)重要的代謝和解毒途徑［51］。螺旋藻中醛酮還原酶的上調(diào)表達(dá)也是對(duì)砷引起的脂質(zhì)過(guò)氧化的應(yīng)激反應(yīng)，同樣的現(xiàn)象在水稻中也有出現(xiàn)，泰國(guó)香米水稻中的AKR 在活性醛解毒途徑也有著獨(dú)特的作用［52］。

乙醇脫氫酶（Alcohol desydrogenase，zinc binding，ADH）是一種含鋅酶，屬于脫氫酶/還原酶（Dehydrogenase/reductase，MDR）蛋白基因超家族的成員［53］，可將乙醛和乙醇相互轉(zhuǎn)換。螺旋藻細(xì)胞內(nèi)ADH 的上調(diào)可能會(huì)起到清除活性醛的作用，以此來(lái)對(duì)抗砷離子引起的的細(xì)胞過(guò)氧化。在梁燕等［54］研究也發(fā)現(xiàn)，水稻中的ADH 具有保護(hù)膜結(jié)構(gòu)功能的完整性，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的功能。

3.2.4 磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)與跨膜相關(guān)蛋白P和As 屬同族元素，由于兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，As（Ⅴ）可通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)通道被浮游植物吸收［9，55］。螺旋藻培養(yǎng)液中添加砷離子不可避免會(huì)影響磷代謝，磷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Regulator）下調(diào)表明其跨膜運(yùn)輸受到干擾，同時(shí)磷酸結(jié)合蛋白（Phosphate-binding protein）通過(guò)上調(diào)以結(jié)合補(bǔ)充磷。谷氨酰胺合成酶的上調(diào)很有可能是因?yàn)樯殡x子干擾磷代謝造成的。谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase）通過(guò)催化谷氨酸鹽與銨生成谷氨酰胺，此反應(yīng)消耗一個(gè)ATP 的同時(shí)釋放焦磷酸鹽，后者可被降解為無(wú)機(jī)磷酸鹽，補(bǔ)充砷脅迫下減少攝入的磷。杜氏鹽藻在砷脅迫與鹽脅迫下均出現(xiàn)磷酸鹽吸收降低的現(xiàn)象，同時(shí)谷氨酰胺酶都呈現(xiàn)上調(diào)［23，30］，與砷處理下的螺旋藻表現(xiàn)出相同的結(jié)果。

4 結(jié)論

螺旋藻細(xì)胞對(duì)砷離子脅迫十分敏感，當(dāng)外液砷離子濃度達(dá)到1 ppm 時(shí)，螺旋藻細(xì)胞就有明顯的響應(yīng)；當(dāng)外液砷離子濃度達(dá)到2 ppm 時(shí)，就對(duì)螺旋藻細(xì)胞光合放氧產(chǎn)生顯著的影響，并對(duì)螺旋藻光合色素相關(guān)蛋白產(chǎn)生抑制作用。砷離子在藻細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化觸發(fā)了螺旋藻的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生了一系列活性氧清除與防御過(guò)程，75 種差異蛋白指示了這些變化過(guò)程也涉及到能量代謝、蛋白質(zhì)合成與折疊、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，螺旋藻養(yǎng)殖培養(yǎng)液砷離子濃度一定要控制在1 ppm 以下，才可能避免其較大的影響，確保不會(huì)因此減產(chǎn)，從而獲得合格的藻粉和較高的產(chǎn)量。