丁 晟，魏曉慧，楊 焜，李 釩，田 豐

（軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所，天津300161）

0 引言

無論在戰(zhàn)時還是平時，過度失血都是當(dāng)前戰(zhàn)爭和院前急救中引起傷員死亡的主要原因。研究顯示[1-3]，在過去150 a 中，戰(zhàn)爭中的死亡率仍然保持在20%左右，而當(dāng)中超過90%的傷亡人員在到達(dá)野戰(zhàn)醫(yī)院之前就已經(jīng)死亡，其中造成死亡的原因有一半是過度失血。由于應(yīng)急救治必須在黃金時間10 min 內(nèi)完成，所以在現(xiàn)場迅速控制出血對于最終轉(zhuǎn)移到醫(yī)院治療至關(guān)重要。

介孔硅（MSN）具有獨特的結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，可以運用于人體。MSN 具有的大比表面積和孔容使其在創(chuàng)傷止血方面具有良好的性能，近年來得到廣泛的應(yīng)用。人工合成的MSN 具有大比表面積、多孔結(jié)構(gòu)、高容積率等特性，因此具有很強(qiáng)的吸附能力，能夠通過快速吸收血液中的水分從而濃縮局部創(chuàng)面的凝血成分，最終實現(xiàn)快速止血的目的。由于人工合成的MSN 可以保持成分可控的特性，并且其止血效果也更為顯著，許多國內(nèi)外學(xué)者對以MSN 材料為功能核心的止血材料開展了一系列的研究[4-6]。

鈣離子作為參與凝血反應(yīng)的13 種凝血因子之一，對凝血過程本身有著重要的影響。鈣離子（凝血因子Ⅳ）可以促進(jìn)凝血反應(yīng)，并有助于誘導(dǎo)內(nèi)源性凝血級聯(lián)和其他凝血因子的激活和更新，加速產(chǎn)生足夠數(shù)量的凝血酶以加速纖維蛋白的早期形成，催化血液中纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，有利于纖維蛋白的鏈?zhǔn)骄酆虾湍姆€(wěn)定性。而纖維蛋白可以形成血凝塊，從而堵塞傷口，達(dá)到止血的目的[7-8]。

因此，本研究通過人工合成可控的MSN，穩(wěn)定控制MSN 的孔徑和粒徑，在單純MSN 材料基礎(chǔ)上負(fù)載鈣離子，從而增強(qiáng)MSN 的止血性能，并進(jìn)行綜合評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

正硅酸乙酯（TEOS）、溴化十六烷基三甲銨（CTAB）、正辛烷、賴氨酸、甲基丙烯酸甲酯（MMA）和偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（AIBA）都來自百靈威公司。硝酸鈣[Ca（NO3）2·4H2O]來自Sigma 公司。

透射電子顯微鏡（JEM-2100F，JEOL，日本），X射線光子能譜儀（D8 Advance，Buker，德國），傅里葉紅外光譜分析儀（Nicolet 380，Thermo，美國），血栓彈力圖儀（CFMS LEPU-8800，樂普，中國）。

1.2 樣品制備

將300 mg CTAB 溶于96 ml 去離子水中，在整個過程中通過氮氣清洗并持續(xù)攪拌1 h，溫度保持在70 ℃，最終得到澄清溶液。整個實驗中保持一直通氮氣，加入9 ml 的正辛烷攪拌30 min 后，再加入3.5 ml的MMA、66 mg 賴氨酸、3 000 mg TEOS、0.84 mg的AIBA，以800 r/min 攪拌反應(yīng)4 h，最終得到單相乳白色液體。冷卻至室溫后靜置12 h，之后以15 000 r/min 離心15 min 進(jìn)行純化，并使用無水乙醇洗去多余的有機(jī)溶劑，在自然環(huán)境下以600 ℃煅燒5 h，最后得到MSN 基材。

將MSN 基材與0.5、1.0、1.5 mol/L的硝酸鈣溶液混合攪拌，之后進(jìn)行抽濾收集，在真空干燥箱烘干得到樣品Ca0.5MSN、Ca1.0MSN、Ca1.5MSN。通過凝血實驗選出具有最佳止血性能的混合濃度，并進(jìn)行材料物化性能的表征及生物安全性檢測。

1.3 材料凝血性能的評價和篩選

1.3.1 血栓彈力圖儀測試

采用樂普公司生產(chǎn)的西芬斯?CFMS LEPU-8800血栓彈力圖儀來測試樣品的凝血性能。測試方法如下：在測試前，將樣品放置于80 ℃的真空干燥箱進(jìn)行干燥以去除水分。稱取10 mg 樣品粉末于小試管，加入1 ml 的抗凝全血并用旋渦混合器混合相同時間使其混合均勻。之后吸取340 μl 的混合物于37 ℃環(huán)境下加入凝血杯中，然后加入20 μl 的0.2 mol/L的CaCl2溶液，并立即啟動血栓彈力圖儀進(jìn)行測試，得出血栓彈力圖曲線。其中不加樣品的抗凝全血作為空白對照組，每組樣品重復(fù)測試3 次。

1.3.2 活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶原時間（PT）測試

APTT 反映內(nèi)源性凝血途徑的激活狀態(tài)，而PT與外源性凝血途徑的激活狀態(tài)有關(guān)，兩者皆屬于臨床的基本血凝檢測。

APTT 測試方法：在試管中加入0.1 ml APTT 試劑和0.1 ml 貧血小板血漿以及樣品2 mg。在37 ℃水浴中孵育3 min 后，在試管中加入0.1 ml 預(yù)熱的CaCl2（0.025 mol/L），同時開始測定APTT。

PT 測試方法：將0.1 ml 貧血小板血漿加入含有2 mg 樣品的試管中，在37 ℃水浴中孵育3 min 后，在試管中加入0.1 ml 預(yù)熱的PT 試劑，同時開始測定PT。

APTT 和PT 測試均是將不加樣品的抗凝全血作為對照組，每組樣品至少重復(fù)測試3 次。

1.3.3 體外全血凝固時間（CBT）測試

CBT 能夠更加直觀地反映樣品的凝血性能，從而評價樣品的凝血能力。CBT 測試方法：將20 mg的樣品加入10 ml 的試管中，于37 ℃水浴中孵育3 min，加入1 ml 的抗凝全血并繼續(xù)孵育1 min，之后在試管中加入500 μl 的0.025 mol/L 的CaCl2溶液。于水浴37 ℃環(huán)境下每隔15 s 傾斜試管并觀察血液是否流動，直至將試管傾斜90°血液不再流動即為凝血，記錄凝血時間。其中不加樣品的抗凝全血作為空白對照組，每個樣品重復(fù)測量3 次。

1.4 材料物化性能的表征

1.4.1 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）分析

測試前取少量樣品置于乙醇中超聲分散15 min，之后取超聲分散后的懸浮液滴到載有碳膜的銅網(wǎng)上，晾干后采用日本JEOL 公司的JEM-2100F 型透射電子顯微鏡（工作電壓200 kV）觀察樣品的結(jié)構(gòu)。

1.4.2 X 射線衍射（diffraction of X-rays，XRD）分析

分析前將樣品置于80 ℃烘箱干燥除去水分，用壓片法制片。XRD 檢測時采用Cu-Kα 靶（入射線波長λ=0.156 04），管流30 mA，管壓30 kV。其中廣角XRD 以每步0.02°的速度從5°到80°掃描，掃描速度為4°/min；小角XRD 以每步0.02°的速度從0.5°到10°掃描，掃描速度為4°/min。

1.4.3 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

使用KBr 壓片法，先將樣品置于80 ℃干燥箱充分干燥后，取少量樣品以1∶100 的比例與KBr 在研缽中混勻后置于不銹鋼壓模中壓片成型，之后采用紅外光譜分析儀對樣品進(jìn)行FTIR 分析，在紅外光譜分析儀中以分辨力0.09 cm-1、掃描范圍4 000～400 cm-1觀察樣品對波譜的吸收情況。

1.5 生物安全性檢測

1.5.1 血液相容性

通過溶血實驗[9]來評價樣品的血液相容性。將2 ml 抗凝全血（由3.8 wt%的檸檬酸鈉水溶液抗凝劑與新鮮血液以1∶9 的比例均勻混合得到）與8 ml 無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）混合，以2 500g 離心力離心15 min 后移去上層液體，并用無菌PBS 洗滌下層的紅細(xì)胞數(shù)次，直至上層清液為無色。將紅細(xì)胞與無菌PBS 以1∶9 的比例均勻混合形成紅細(xì)胞懸液。以1 mg 粉末樣品與1 ml 紅細(xì)胞懸液混合作為實驗組，1 ml 的紅細(xì)胞懸液作為陰性對照組，0.1 ml 紅細(xì)胞和0.9 ml 無菌去離子水作為陽性對照組。37 ℃孵育1 h 后，將實驗組和對照組高速離心15 min，吸取上層清液，用紫外分光光度計測量540 nm 波長的吸光度，并使用以下公式計算溶血率：

1.5.2 細(xì)胞毒性分析（CCK-8 染色）

通過CCK-8 染色[10]檢測樣品對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響來分析其生物相容性。同時為了分析樣品濃度變化對細(xì)胞的影響，設(shè)置低濃度320 μg/ml 和高濃度640 μg/ml 來檢測樣品對細(xì)胞毒性的變化。將內(nèi)皮細(xì)胞以10 000 個/孔接種于96 孔板中，每孔200 μl 培養(yǎng)24 h。分別加入200 μl 的320 和640 μg/ml 的樣品，對照組每孔加入200 μl 的PBS，培養(yǎng)24 h。丟棄孔內(nèi)液體，細(xì)胞用PBS 沖洗幾次后，每孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl 的CCK-8 溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm 下檢測吸光強(qiáng)度（去除背景光）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析比較多組間的差異，采用t 檢驗比較2 組間的差異，其中P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料凝血性能的評價與篩選結(jié)果

2.1.1 血栓彈力圖儀測試結(jié)果

血栓彈力圖儀是通過監(jiān)測血液凝固過程中血凝塊的黏彈性來診斷血液凝固的全面有效的方法。其中觀測血栓彈力圖儀與凝血相關(guān)的主要參數(shù)為R、α和MA。R 值為凝血反應(yīng)時間，表示從凝血系統(tǒng)啟動到纖維蛋白凝塊開始形成的時間；α 值為凝固角，是從凝塊形成點到曲線最大弧度作切線與水平線的夾角；MA 值代表最大振幅，表示血凝塊的強(qiáng)度和硬度。各組血栓彈力圖相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 各組血栓彈力圖相關(guān)參數(shù)

表1 的實驗結(jié)果顯示，鈣離子的引入能夠顯著降低R 值，增大α、MA 值，表明鈣離子的引入可以加快凝血速度，縮短開始凝血的時間以及加強(qiáng)血凝塊強(qiáng)度，而隨著鈣離子的增加，R 值會上升，開始凝血時間變長，止血效果會下降。血栓彈力圖如圖1 所示。

2.1.2 APTT 和PT 測試結(jié)果

本研究通過檢測APTT、PT 來判斷材料是否激活內(nèi)源性或外源性的凝血途徑。

APTT 實驗結(jié)果（如圖2 所示）表明，MSN 能夠有效地降低APTT 值，引入鈣離子后APTT 值降低更多，但是增加鈣離子，Ca1.0MSN、Ca1.5MSN 與Ca0.5MSN沒有顯著性差異，效果相近。止血效果的增強(qiáng)可能是因為鈣離子本身是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)中第Ⅳ因子，可以加速凝血系統(tǒng)的啟動。

PT 實驗結(jié)果如圖3 所示，相對于對照組，所有樣品的PT 值均沒有顯著性差異，說明材料對外源性凝血途徑?jīng)]有影響。

APTT 和PT 實驗表明，所有材料主要是激活內(nèi)源性凝血途徑來促進(jìn)止血，對外源性凝血途徑?jīng)]有顯著影響。

圖2 不同組分MSN 的APTT 結(jié)果

圖3 不同組分MSN 的PT 結(jié)果

2.1.3 CBT 測試結(jié)果

CBT 是一種能直觀反映凝血性能的基礎(chǔ)性檢測，測試結(jié)果如圖4 所示。所有材料均能有效降低CBT 值，同時引入鈣離子后CBT 值顯著降低，表明鈣離子的加入對止血有促進(jìn)作用，并且Ca1.0MSN 的CBT 最短，效果最好，與凝血實驗結(jié)果一致，因此選用制備的Ca1.0MSN 材料進(jìn)行進(jìn)一步探究。

圖4 不同組分MSN 的CBT 結(jié)果

2.2 材料的物化性能

2.2.1 TEM 分析結(jié)果

用TEM 分析不同組分MSN 的形貌結(jié)果如圖5所示。合成的樣品均具有相同尺寸的單分散球形，平均孔徑約為12 nm，平均粒徑約為50 nm。且顆粒表面和顆粒內(nèi)部的孔道呈放射狀，部分MSN 呈空心狀。結(jié)果表明，鈣離子的引入對樣品的形貌影響不大，成功合成的樣品具有較大的孔徑，對止血具有促進(jìn)作用。

圖5 不同組分MSN 的TEM 圖

2.2.2 XRD 分析結(jié)果

研究表明[11-12]非晶態(tài)MSN 的毒性要比晶態(tài)MSN的毒性低，而XRD 是用來表征介孔材料的常用手段，其中衍射峰是確認(rèn)材料晶型和介孔結(jié)構(gòu)的有力證據(jù)。各樣品的XRD 圖譜沒有明顯差異，如圖6 所示。通過小角XRD 發(fā)現(xiàn)在約1°處只有一個峰出現(xiàn)，表明所有樣品都是非晶態(tài)的介孔結(jié)構(gòu)；廣角XRD 只有一個峰出現(xiàn)在10～40°，沒有其他具有晶體結(jié)構(gòu)特征的衍射峰，說明鈣以非晶態(tài)形式存在于介孔材料MSN的骨架中。因此，鈣離子的引入對MSN 的結(jié)構(gòu)沒有影響。

圖6 不同組分MSN 的XRD 圖

2.2.3 FTIR 分析結(jié)果

為了檢測篩選出的最佳效果樣品的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，對樣品進(jìn)行了FTIR 分析。如圖7 所示，由于鈣離子的引入，在1 350 cm-1左右處出現(xiàn)了硝酸根的吸收峰（1 350～1 380 cm-1），此外Si-OH 峰（3 200～3 400 cm-1）的存在表明樣品存在硅烷醇基團(tuán)，并且其具有極強(qiáng)活性的羥基，可以脫氫生成陰性離子狀態(tài)的SiO-，與離子進(jìn)行結(jié)合。結(jié)果表明，MSN能夠成功負(fù)載鈣離子，并且引入離子后出現(xiàn)了硝酸根吸收峰，但其他峰沒有明顯變化，表明MSN 結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生變化。

圖7 不同組分MSN 的FTIR 圖像

2.3 生物安全性檢測結(jié)果

2.3.1 血液相容性檢測結(jié)果

通過溶血率來評價材料的血液相容性時，止血材料的溶血率低于5%[13]才能認(rèn)為血液相容性較好。測試樣品的溶血率均遠(yuǎn)低于5%并且沒有顯著性差異，其中MSN 的溶血率為（2.6±0.3）%，Ca1.0MSN 的溶血率為（2.9±0.5）%，這表明鈣離子的引入不會影響MSN的血液相容性。血液相容性實驗結(jié)果如圖8 所示。

圖8 血液相容性實驗結(jié)果圖

2.3.2 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

通過測得的吸光度值來判斷活細(xì)胞的數(shù)量，從而評價材料的生物相容性。吸光度值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。圖9 表明MNS 材料擁有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞繁殖，且低濃度下增殖效果比高濃度下更好。

圖9 不同濃度下樣品對細(xì)胞增殖的影響

3 結(jié)論

本研究制備了一種有序的具有可控孔徑的MSN納米顆粒，并且將其負(fù)載鈣離子，以增強(qiáng)止血性能。通過一系列實驗，評價了其止血效果和生物安全性能。實驗結(jié)果表明，優(yōu)化后的Ca1.0MSN 能顯著激活內(nèi)源性凝血通路途徑，促進(jìn)凝血，并且具有良好的生物活性，擁有良好的細(xì)胞增殖效果。與MSN 相比，鈣離子的引入可以提高M(jìn)SN 的止血效果及生物活性，并且不會造成結(jié)構(gòu)上的明顯改變。因此，Ca1.0MSN 作為一種先進(jìn)的止血材料具有很大的應(yīng)用潛力，未來可應(yīng)用在院前急救以達(dá)到快速止血的目的，在軍事和民用創(chuàng)傷急救中也表現(xiàn)出優(yōu)秀的止血性能。本研究的不足之處在于沒有進(jìn)一步探究混合硝酸鈣濃度的影響，且共混的方式制備復(fù)合材料的穩(wěn)定性有所不足。下一步研究方向是進(jìn)一步細(xì)化分析硝酸鈣濃度的影響，并且在制備MSN 時直接嘗試引入鈣離子，探究一步法制備復(fù)合材料的可行性。