邱 麒，黃 鑫，唐宇恒，劉俊杰，孫春曉，許阿娟，賴文芳，洪桂祝

(1. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建 福州 350101； 2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，同冠心病、癌癥并列為威脅人類健康的三大疾病之一，其中缺血性腦卒中約占87%，嚴(yán)重威脅著卒中患者的生命健康和生活質(zhì)量[1]。紅景天(RhodioldroseaL.)屬于薔薇目景天科，是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中的重要草藥，具有改善心血管功能，保護肝臟，抗衰老，以及神經(jīng)保護等多種藥理作用[2]。紅景天苷(salidroside，Sal)是從紅景天中提取出來的苯乙醇類化合物，是紅景天主要有效成分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠降低腦梗死體積，改善神經(jīng)功能損傷，降低C3補體成分，促進Egrs家族蛋白表達，調(diào)控Bcl-xl/Bax蛋白，減少神經(jīng)凋亡[3-7]。而糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能作用于眾多信號蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡，目前越來越多的研究者選擇其作為癌癥、神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)精神類疾病等多種重大疾病的治療靶點[8-9]。本研究以GSK-3β為治療靶點，進一步探討紅景天苷腦保護的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級健康♂SD大鼠86只，體質(zhì)量 (260～280) g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2015000510392，許可證號：SCXK(滬)2017-0005，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SYXK(閩)2014-0005。

1.2 藥品與試劑紅景天苷(福建中醫(yī)藥大學(xué)，純度≥98%，批號：20160928)；線栓(廣州佳靈技術(shù)有限公司)；RIPA(碧云天生物技術(shù)有限公司)，PMSF(碧云天生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，均來自碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白上樣緩沖液(生工生物工程上海有限公司)；鼠抗β-actin(北京全式金公司)；caspase-9，cleaved caspase-9，GSK-3β，NMDAR1，GluR2(Cell Signaling Technology 公司)，pGSK-3β(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.3 儀器Infinite M20 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)，小型垂直電泳槽，小型轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad)，基礎(chǔ)電泳儀電源(Bio-Rad)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad,型號：ChemiDocXRS+)，高速臺式冷凍離心機(Thermo Fisher，型號：PrimoR)。

1.4 藥品配制紅景天苷注射液：稱取紅景天苷粉末1.5 g溶入0.2 L 0.9%生理鹽水中，充分溶解至澄清，4 ℃保存待用。

2 方法

2.1 動物分組和給藥第一批：SD大鼠造模成功后隨機分為假手術(shù)組(Sham)12 只、模型組(MCAO)12 只、紅景天苷給藥組(MCAO+Sal)12 只。造模2 h，再灌注1 h后，MCAO+Sal組腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg-1·d-1)，其余組注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1)，給藥1 d后取材。

第二批：SD大鼠隨機分為6組，即人工腦脊液+Sham組(Sham)、GSK-3β抑制劑+Sham組(SB216763+Sham)、人工腦脊液+MCAO組(MCAO)、GSK-3β抑制劑+MCAO組(SB216763+MCAO)，人工腦脊液+MCAO+Sal組(MCAO+Sal)，GSK-3β抑制劑+MCAO+Sal組(SB216763+MCAO+Sal)，每組各10 只。經(jīng)側(cè)腦室注射GSK-3β抑制劑SB216763或人工腦脊液30分鐘后，除假手術(shù)組外，其余組進行MCAO造模，造模后MCAO+Sal和SB216763+MCAO+Sal組腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg-1·d-1)，其余組注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1)，給藥1 d后取材。

2.2 MCAO模型制作大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，除去頸部的毛并用碘伏擦拭頸部皮膚消毒后，剪開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎 CCA、ECA。動脈夾夾閉 ICA，使用眼科剪呈45°在CCA近心端血管壁上剪一小口，插入線栓至大腦中動脈起始端。2 h后再次麻醉大鼠，將線栓抽出并結(jié)扎開口，實現(xiàn)再灌注，假手術(shù)組不進行插線栓操作。參考Zea-Longa的5級4分法[10]進行神經(jīng)功能評分，評分 ≥2 分的實驗動物為模型制作成功，用于后續(xù)實驗。

2.3 Western blot 檢測cleaved caspase-9、GSK-3β、NMDAR1、GluR2的表達取新鮮大鼠左腦組織，用剪刀把組織剪切成細(xì)小碎片。稱取100 mg加入1 mL蛋白裂解液(含有1%PMSF+1%蛋白磷酸酶抑制劑)進行勻漿，再4 ℃離心10 min后小心吸取上清至干凈的管中，即得總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。

蛋白采用SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)至預(yù)先活化好的PVDF膜上，麗春紅染色觀察膜上是否有清晰條帶，再用5% BSA封閉 2 h后孵育一抗4 ℃過夜，一抗根據(jù)抗體說明書稀釋比例制備，caspase-9(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶1 000)、NMDAR1(1 ∶1 000)、GluR2(1 ∶1 000)。次日搖床室溫孵育二抗2 h，PVDF膜用TBST洗滌(10 min×3)之后加ECL顯色劑，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測，以β-actin為內(nèi)參，分析目的條帶/β-actin的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織cleaved caspase-9蛋白表達的影響MCAO模型大鼠給藥1 d，與Sham組比較，MCAO模型大鼠缺血側(cè)cleaved caspase-9蛋白表達增加。經(jīng)紅景天苷干預(yù)后，cleaved caspase-9蛋白表達降低，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(Fig 1)。

3.2 紅景天苷對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達的影響與Sham組比較，MCAO模型大鼠缺血側(cè)pGSK-3β、NMDAR1、GluR2的蛋白表達量顯著降低。經(jīng)紅景天苷作用后，顯著促進pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(Fig 2)。

3.3 側(cè)腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織中cleaved caspase-9蛋白表達的影響側(cè)腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷后，與MCAO組比較，MCAO+Sal組可明顯降低MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織中cleaved caspase-9的蛋白表達，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而側(cè)腦室注射SB216763后cleaved caspase-9蛋白表達無變化(Fig 3)。

Fig 1 Effects of salidroside treatment on cleaved caspase-9 protein in MCAO ##P<0. 01 vs Sham，**P<0. 01 vs MCAO

Fig 2 Effects of salidroside treatment on pGSK-3β, NMDAR1, GluR2 protein in MCAO n=6)##P<0. 01 vs Sham, **P<0. 01 vs MCAO

Fig 3 Effects of salidroside or SB216763 treatment on caspase-9 protein in MCAO ##P<0.01 vs Sham,**P<0.01 vs MCAO, △P<0.05 vs SB216763+Sham,▲▲P<0.01 vs MCAO+Sal

3.4 側(cè)腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織中pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達的影響側(cè)腦室注射GSK-3β抑制劑和腹腔注射紅景天苷后，與MCAO組比較，MCAO+Sal組可明顯降低MCAO模型大鼠缺血側(cè)腦組織中pGSK-3β、NMDAR1、GluR2蛋白表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而側(cè)腦室注射SB216763后pGSK-3β、NMDAR1、GluR2表達均無變化(Fig 4)。

4 討論

目前，神經(jīng)元凋亡被認(rèn)為是腦缺血損傷后繼發(fā)性損害的重要機制，GSK-3β作為一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其活性主要由膚鏈中所含絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)的磷酸化水平?jīng)Q定，Tyr216磷酸化后GSK3β活性增強而Ser9的磷酸化則抑制GSK3β活性。在腦缺血/再灌注時，活化后的GSK可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)線粒體mPTP開放程度，進而影響細(xì)胞色素C( Cyt-c)釋放，caspase-9發(fā)生自我催化，活化的caspase-9 進一步誘導(dǎo)caspase-3進行切割并使之激活，使級聯(lián)反應(yīng)進一步放大，被激活的caspase-3通過對caspase靶蛋白的水解，進一步加重凋亡損傷[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-9前體被大量激活，cleaved caspase-9增多，經(jīng)紅景天苷干預(yù)后，翻轉(zhuǎn)該結(jié)果，提示紅景天苷能抑制神經(jīng)細(xì)胞的線粒體依賴途徑凋亡。同時，實驗中發(fā)現(xiàn)紅景天苷給藥組的神經(jīng)功能損傷明顯低于模型組，且GSK-3β磷酸化水平升高，表明紅景天苷可以促進GSK-3β磷酸化，抑制其活性。

Fig 4 Effects of salidroside or SB216763 treatment on pGSK-3β,NMDAR1, GluR2 protein in MCAO n=6)##P<0.01 vs Sham, **P<0.01 vs MCAO, △P<0.05 vs SB216763+Sham,▲▲P<0.01 vs MCAO+Sal

有研究表明，紅景天苷可以抑制鈉通道從而抑制突觸的Glu釋放和交感神經(jīng)傳遞而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減輕腦缺血/再灌注損傷[13]。在海馬組織絕大部分神經(jīng)元突觸表面的受體含有G1uR2亞基，腦缺血繼發(fā)性損傷刺激可使GluR2表達下降，導(dǎo)致鈣離子通過AMPA受體離子通道內(nèi)流增加，加重神經(jīng)元損傷[14]。同時NMDA1受體(N-methyl-D-aspartate receptor)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的興奮性氨基酸，能夠參與腦缺血病理狀態(tài)下的興奮毒性機制，位于突觸外的NMDAR過度激活會導(dǎo)致興奮性毒性，位于突觸內(nèi)的NMDAR激活可以促進細(xì)胞存活。本研究表明，經(jīng)紅景天苷干預(yù)后，能夠增加大鼠腦缺血側(cè)腦組織中NMDA1和GluR2的蛋白表達，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Patrick等[15]研究表明NMDA1受體和GluR2的分布與表達是治療腦缺血和心肌缺血的重要機制。但是關(guān)于其上游調(diào)控機制鮮有報道。而PI3K/Akt信號通路是最主要的神經(jīng)細(xì)胞存活信號通路，Akt可促使GSK-3β磷酸化增多，抑制其活性從而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡屢有報道。為了證實紅景天苷對caspase-9、NMDA1和GluR2的調(diào)節(jié)作用是通過影響GSK-3β的活性發(fā)揮作用，我們使用GSK-3β抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射SB216763后再給予紅景天苷治療，結(jié)果顯示以上蛋白無變化。提示紅景天苷是通過促進GSK-3β的磷酸化，降低caspase-9、NMDA1和GluR2的表達，減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用。為探究紅景天苷抗細(xì)胞凋亡的腦保護作用研究奠定基礎(chǔ)。

(本實驗在福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研發(fā)中心及省級中藥學(xué)重點實驗室完成，感謝所有老師及同學(xué)們的支持與幫助！)