熊庭旺，吳 芹，劉 杰，劉 波，徐云燕，王麗娜，張 瑋，張成宸，石京山

(遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，特色民族藥國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

焦慮/抑郁癥是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類身心健康的兩種常見(jiàn)精神疾病，給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1]。焦慮/抑郁常同時(shí)發(fā)生，目前常用的焦慮/抑郁癥動(dòng)物模型主要有應(yīng)激誘導(dǎo)型焦慮/抑郁模型和藥物誘導(dǎo)型焦慮/抑郁模型等[2-3]。但這些造模方式普遍存在著操作復(fù)雜、可重復(fù)性差等不足，使得焦慮/抑郁癥的基礎(chǔ)研究備受限制。因此，發(fā)掘一種遺傳性的焦慮/抑郁動(dòng)物模型無(wú)疑具有重要的意義。

Fawn-Hooded(FH/Wjd)大鼠是由Wistar大鼠近親繁殖到第19代得到的近交系大鼠，具有飲酒量大、酒精偏愛(ài)度高、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)異常、行為絕望明顯等特征，其抑郁特性已得到明確，是研究抑郁癥的理想的動(dòng)物模型[4-6]。然而，F(xiàn)H/Wjd大鼠的焦慮特性及其相關(guān)生化改變的深入研究目前尚不明確。因此，本研究基于既往研究基礎(chǔ)，以Sprague-Dawley(SD)大鼠為對(duì)照[4-8]，觀察FH/Wjd大鼠的焦慮特性及其機(jī)制，為FH/Wjd大鼠在神經(jīng)精神領(lǐng)域的應(yīng)用提供部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑Topscan曠場(chǎng)、高架十字迷宮行為學(xué)系統(tǒng)(Cleversys Inc.美國(guó))；CoulochemⅢ高效液相庫(kù)倫陣列電化學(xué)儀(ESA美國(guó))；Excellence Plus天平XP型(梅特勒-托利多瑞士)；Multistan Go多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo美國(guó))；NANO DROP 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad 美國(guó))。大鼠兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)、單胺氧化酶(monoamine，MAO)、皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ATCH)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)分別為JL13490、JL12455、JL11379。3，4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、多巴胺(dopamine，DA)、高相草酸(homovanillicacid，HVA)、5-HT、5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為153-98-0、BCBP2642V。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自大連寶生物公司，SYBR PCR Mix(Bio-Rad 美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡♂SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(300～350) g，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)為：SCXK(渝)2017-0005]。3月齡♂ FH/Wjd大鼠，體質(zhì)量(280～300) g，由北京大學(xué)藥物依賴研究所梁建輝教授饋贈(zèng)，并引進(jìn)繁殖，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房(許可證號(hào)：SYXK 黔 2014-003)，12 h光照/黑夜循環(huán)，室溫(21～25) ℃，濕度50%～60%。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)是由一對(duì)高開(kāi)臂和一對(duì)閉合臂組成。利用大鼠對(duì)新異環(huán)境的好奇、探究特性與高空畏懼回避所形成的矛盾沖突來(lái)評(píng)價(jià)其焦慮狀態(tài)。將大鼠從中央?yún)^(qū)域面朝開(kāi)放臂放入，儀器記錄10 min內(nèi)大鼠在各臂的活動(dòng)情況。

1.3.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)箱是由4個(gè)長(zhǎng)、寬、高均為40 cm的方形盒子組成，箱子底部被劃分為中央?yún)^(qū)域和外周區(qū)域。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)利用大鼠的趨避性與面對(duì)開(kāi)闊環(huán)境的探索驅(qū)動(dòng)所形成的矛盾沖突，來(lái)評(píng)價(jià)其緊張度和焦慮行為。將大鼠從固定的一角放入，使其自主活動(dòng)10 min，記錄大鼠在外周及中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)情況。

1.4 DA、5-HT及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)

1.4.1色譜條件 QUATTRO 3 C18反相氨基酸色譜柱，150×2.1 mm(Chrom4，USA)，內(nèi)徑5 μm。流動(dòng)相為pH3.2的緩沖液[含50 mmol·L-1檸檬酸鈉，90 mmol·L-1磷酸氫二鈉，1.7 mmol·L-1辛烷磺酸鈉，0.5 μmol·L-1乙二胺四乙酸鈉]-乙腈(92:8，V/V)。0.22 μm濾膜抽濾，超聲脫氣15 min，HPLC儀使用前流動(dòng)相平衡過(guò)夜。電化學(xué)檢測(cè)器工作電極為石墨碳，檢測(cè)參數(shù)ChannelⅠ-150 mV，ChannelⅡ 300 mV，guard cell 350 mV。柱溫30 ℃，流速0.21 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2樣本制備 稱取皮層組織約80 mg，按1 mg組織對(duì)應(yīng)加入12.5 μL 5%的HClO4溶液，冰上勻漿，后轉(zhuǎn)移置1.5 mL離心管中4 ℃ 14 000×g離心10 min去蛋白，取上清按1 ∶2的體積加入流動(dòng)相稀釋，混勻后用0.22 μm針頭濾器過(guò)濾樣本，進(jìn)樣。

1.5 ELISA實(shí)驗(yàn)稱取皮層組織，按1 ∶9的重量體積比例，加入PBS，冰上充分研磨，將勻漿液于4 ℃ 5 000×g離心10 min，分裝上清液，凍存于 -80 ℃，待測(cè)。按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR[9]取(50～100) mg組織置于1 mL TRIzol中冰上勻漿，提取組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)。PCR引物由上海生工生物有限公司合成，GAPDH上游序列5′-CCAAGGAGTAAGACCCCTGG-3′，下游序列5′-AGGGGAGATTCAGTGGTG-3′，COMT上游序列5′-CCAGCAGCTCACACCACATC-3′，下游序列5′-ATGCCTCTGCCTCCTG GATA-3′。

1.7 mRNA-seq檢測(cè)取SD、FH/Wjd大鼠海馬樣本，送至上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行mRNA-seq測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 FH/Wjd大鼠與SD大鼠焦慮行為比較Fig 1A所示，與SD大鼠比較，F(xiàn)H/Wjd大鼠在EPM閉合臂的活動(dòng)距離及活動(dòng)總路程均顯著高于SD大鼠(P<0.05；P<0.05)；Fig 1B所示，F(xiàn)H/Wjd大鼠在OFT中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的距離低于SD大鼠，活動(dòng)總路程顯著高于SD大鼠(P<0.05)。

2.2 FH/Wjd大鼠與SD大鼠中樞DA代謝比較Fig 2A所示，與SD大鼠比較，F(xiàn)H/Wjd大鼠皮層DA、DOPAC含量較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HVA含量無(wú)明顯差異；Fig 2B所示，F(xiàn)H/Wjd大鼠DOPAC/DA無(wú)明顯差異，HVA/DA顯著較高(P<0.05)；Fig 2C所示，F(xiàn)H/Wjd大鼠皮層組織中COMT活性顯著較高(P<0.01)。

2.3 FH/Wjd大鼠與SD大鼠中樞5-HT代謝比較Fig 3A所示，與SD大鼠比較，F(xiàn)H/Wjd大鼠皮層組織中5-HT(P<0.01)含量顯著較低，5-HIAA含量無(wú)差異；Fig 3B所示，F(xiàn)H/Wjd大鼠5-HT代謝率顯著較高(P<0.01)；皮層組織MAO活性顯著較高(P<0.01，F(xiàn)ig 3C)。

2.4 FH/Wjd大鼠與SD大鼠皮層CORT、ACTH含量比較Fig 4所示，F(xiàn)H/Wjd大鼠皮層CORT、ACTH含量均顯著高于SD大鼠(P<0.01；P<0.01)。

2.5 FH/Wjd大鼠與SD大鼠大腦及血清COMT含量比較Fig 5所示，F(xiàn)H/Wjd大鼠皮層、海馬、紋狀體及血清中COMT mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于SD大鼠(P<0.01)。

2.6 mRNA-seq測(cè)序結(jié)果

2.6.1FH/Wjd大鼠與SD大鼠海馬組織主成分分析 在兩個(gè)主成分(PC1、PC2)的情況下，得分圖中能夠觀察到SD大鼠與FH/Wjd大鼠的基因在不同緯度上各自聚類，SD大鼠與FH/Wjd大鼠顯著區(qū)別。

2.6.2FH/Wjd大鼠與SD大鼠差異基因富集通路 KEGG通路富集顯示SD大鼠與FH/Wjd大鼠差異基因在神經(jīng)活性配體受體途徑富集程度最高，見(jiàn)Fig 7。

Fig 1 Difference in anxiety behaviors between FH/Wjd rats and SD n=9～10)The results of elevated plus maze test (A) and open field test (B).*P<0.05 vs SD group.

Fig 2 Difference in metabolism of DA between FH/Wjd rats and SD n= 9～10)The contents of DA, DOPAC and HVA in rats cortex tissues detected by HPLC-ECD(A); The metabolism ratio of DA (B); The enzyme activity of COMT in rats cortex tissue detected by ELISA(C).*P<0.05 vs SD group,**P<0.01 vs SD group.

Fig 3 Difference of 5-HT metabolism between FH/Wjd rats and SD n=9～10)The contents of 5-HT and 5-HIAA in rats cortex tissues detected by HPLC-ECD (A), the metabolism ratio of 5-HT(B), the enzyme activity of MAO in rats cortex tissue detected by ELISA(C). **P<0.01 vs SD group.

Fig 4 Contents of CORT and ACTH in cortex tissues between FH/Wjd rats and SD rats detected by ELISA n=9～10)**P<0.01 vs SD group.

2.6.3FH/Wjd大鼠與SD大鼠神經(jīng)活性受體配體途徑具體差異基因的熱圖 SD大鼠與FH/Wjd大鼠富集在神經(jīng)活性受體配體途徑的主要差異基因有18個(gè)：Cnr2、Nmur2、Avpr1a、Fshb、P2ry2、Ntsr1、Calcr、Gabre、Npffr2、Lpar3、Mlnr、Rxfp3、Chrna5、Tacr3、Sstr1、Ptgdr、C5ar1、P2rx1，其功能涉及突觸傳遞、神經(jīng)元投射、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等方面(Fig 8)。

3 討論

既往研究表明，與SD大鼠比較， FH/Wjd大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯較長(zhǎng)，糖水偏愛(ài)率較低；水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中在棒停留時(shí)間較短，具有明顯的行為絕望、快感缺失、學(xué)習(xí)記憶低、疲勞耐力差等顯著抑郁特性[4,7]。EPM、OFT是利用探索與回避形成的矛盾沖突來(lái)評(píng)價(jià)焦慮行為的經(jīng)典方法[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)H/Wjd大鼠在EPM和OFT中自發(fā)活動(dòng)性較高，EPM臂閉活動(dòng)距離較多，OFT中央?yún)^(qū)域活動(dòng)距離較少，因此，與SD大鼠比較，F(xiàn)H/Wjd大鼠同時(shí)也具有明顯的焦慮行為及高活動(dòng)性。

Fig 5 Expression of COMT mRNA in different tissues between FH/Wjd rats and SD rats detected by real-time n=9～10).**P<0.01 vs SD group.

Fig 6 PCA of transgenic contours of rat hippocampus gene at genome level (n=3)

Fig 7 KEGG analysis of differentially expressed genes between FH/Wjd rats and SD rats (n=3)

Fig 8 Heat map analysis of rat neuroactive ligand-receptor interaction pathway genes(n=3)Red represents up-regulation, green represents down-regulation.

焦慮/抑郁的發(fā)生與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂密切相關(guān)，DA和5-HT是重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[11-12]。DA主要在COMT的作用下被代謝為DOPAC和HVA，5-HT在MAO作用下生成5-HIAA。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)H/Wjd大鼠DA、5-HT含量低于SD大鼠，其變化與FH/Wjd大鼠的抑郁行為相符；同時(shí)，F(xiàn)H/Wjd大鼠COMT、MAO活性、5-HIAA/5-HT、HVA/DA比值均顯著高于SD大鼠，提示FH/Wjd大鼠DA、5-HT代謝亢進(jìn)，其機(jī)制與FH/Wjd大鼠的高活動(dòng)性及焦慮行為相一致。因此，F(xiàn)H/Wjd大鼠中樞DA、5-HT含量低下、但代謝亢進(jìn)等異常表現(xiàn)可能與其抑郁、焦慮共病有關(guān)。

下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸功能紊亂是焦慮/抑郁癥發(fā)生的重要機(jī)制，CORT、ACTH含量能夠一定程度反映HPA軸的功能狀態(tài)[13]。本研究結(jié)果顯示FH/Wjd大鼠CORT、ACTH含量均顯著高于SD大鼠，提示FH/Wjd大鼠存在HPA軸亢進(jìn)，與其焦慮/抑郁的行為學(xué)表現(xiàn)一致。

COMT具有代謝兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)、兒茶酚胺類雌激素和外源性化合物的作用，COMT基因突變引起COMT表達(dá)或活性改變，進(jìn)而與帕金森癥、阿爾茨海默癥、精神分裂癥及注意缺陷障礙、重度抑郁癥等疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)[14]。目前，COMT被視為多種精神疾病的候選基因或診斷標(biāo)志物[15]。研究報(bào)道在注意力缺陷多動(dòng)癥模型、精神分裂癥患者中COMT含量或mRNA的表達(dá)均顯著高于正常組[16]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)H/Wjd大鼠中樞、外周COMT相對(duì)表達(dá)量均較SD大鼠高，提示FH/Wjd大鼠可能存在神經(jīng)精神系統(tǒng)的異常。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還采用了mRNA-seq技術(shù)對(duì)SD大鼠、FH/Wjd大鼠海馬組織中所有的基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，SD大鼠與FH/Wjd大鼠基因表達(dá)存在明顯差異，其差異基因主要富集在神經(jīng)活性受體配體途徑，進(jìn)一步提示了FH/Wjd大鼠在神經(jīng)精神系統(tǒng)的基因表達(dá)存在差異。

綜上所述，本研究通過(guò)FH/Wjd大鼠與SD大鼠比較，發(fā)現(xiàn)FH/Wjd大鼠具有明顯的焦慮行為和高活動(dòng)性，其機(jī)制可能與DA、5-HT含量低下、代謝亢進(jìn)，HPA軸亢進(jìn)，COMT異常，神經(jīng)精神系統(tǒng)的異常有關(guān)。