樊 華,章穎慧,康 強(qiáng),赫愛平,王秀英

(遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心，沈陽 110036)

目前，絕大多數(shù)中藥制劑質(zhì)量控制主要采用理化分析方法，但由于其成分多樣、工藝復(fù)雜等因素，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)項(xiàng)目沒有與藥效學(xué)建立直接的內(nèi)在聯(lián)系，存在一定局限性[1]。生物活性測定法是檢驗(yàn)藥品質(zhì)量的重要檢測手段之一，特別適用于具有多種活性成分或成分復(fù)雜、有效成分不清的中藥制劑。通過生物活性測定法與理化分析技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，致力于尋找一種方便快捷的方式考察血塞注射液生物活性，并通過血塞通注射液探索一條活血化瘀藥通用的生物活性檢定方法，使現(xiàn)有中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)更全面更合理。

1 材料與方法

1.1 供試品和對(duì)照品血塞通注射液(A)，批號(hào)12EJ07，規(guī)格2 ml：100 mg；血塞通注射液(B)，批號(hào)20130303，規(guī)格2 ml：100 mg；血塞通注射液(C)，批號(hào)20130101，規(guī)格10 ml：250 mg。三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)(批號(hào)870-200001)、人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，GRb)(批號(hào)110704-201223)、人參皂苷Rd(ginsenoside Rd，GRd)(批號(hào)111818-201001)，三七皂苷R1(notoginsenoside R1，NR)(批號(hào)110745-200617)、人參皂苷Re(ginsenoside Re， GRe)(批號(hào)110754-201123)、人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，GRg)(批號(hào)110703-201128)均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑和儀器主要試劑:活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)測定試劑盒購自希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司，批號(hào)557183；氯化鈉注射液由雙鶴藥業(yè)(沈陽)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)130718A01；檸檬酸鈉由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)F20090828。主要儀器：全自動(dòng)血凝分析儀CA-1500型由Sysmex公司生產(chǎn)，離心機(jī)Z323K型由德國HERMLE公司生產(chǎn)，十六道生理儀MP100型由BIOPAC SYSTEMS INC.公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔，雌雄兼用，體質(zhì)量(2.5～2.9) kg，購自沈陽藥科大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(遼)2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(遼)2013-0011。

1.4 考察血塞通注射液APTT檢測量效關(guān)系應(yīng)用全自動(dòng)血凝儀檢測不同企業(yè)血塞通注射液(A、B、C)(r=1 ∶0.5)不同劑量對(duì)APTT值的影響，分別取50、25、12.5、6.25、3.125 g·L-1血塞通注射液稀釋液50 μL、兔血漿50 μL、APTT試劑50 μL至血凝杯中，預(yù)熱180 s后，各杯加入CaCl250 μL，測得APTT。

1.5 考察血塞通注射液與三七總皂苷等四種標(biāo)準(zhǔn)品生物活性相關(guān)性血塞通注射液為植物三七中提取的有效部位三七總皂苷制成的滅菌水溶液，故選取三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1做對(duì)照，采用連續(xù)測樣和拉丁方設(shè)計(jì)等方案檢測APTT，具體實(shí)驗(yàn)步驟同上。

1.6 生物活性測定方法的建立應(yīng)用三七總皂苷作為對(duì)照品考察血塞通注射液對(duì)APTT的影響，選取兩批不同企業(yè)的血塞通注射液制成供試品溶液，與相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液分別檢測APTT值，每種濃度至少4次。測得數(shù)據(jù)照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(附錄ⅩⅣ)中的量反應(yīng)平行線測定法計(jì)算效價(jià)及試驗(yàn)誤差。

2 結(jié)果

2.1 考察血塞通注射液APTT檢測量效關(guān)系結(jié)果顯示，血塞通注射液(50、25、12.5、6.25、3.125 g·L-1)存在顯著地量效關(guān)系，且應(yīng)用不同兔血漿、不同企業(yè)供試品測得的結(jié)果接近，較為穩(wěn)定。初步判斷，選用APTT指標(biāo)和該檢測方法控制血塞通注射液產(chǎn)品質(zhì)量基本可行。

2.2 考察血塞通注射液與三七總皂苷等標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血塞通注射液與三七總皂苷存在明顯的相關(guān)性；進(jìn)一步尋找哪種成分對(duì)APTT作用較強(qiáng)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1三種標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)濃度APTT結(jié)果不滿意，且與血塞通注射液無相關(guān)性；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd、人參皂苷Re應(yīng)用氯化鈉注射液稀釋極難溶解，故無法進(jìn)行APTT檢測。

2.3 生物活性測定方法建立測得數(shù)據(jù)依據(jù)《中國藥典》2015年版生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的量反應(yīng)平行線測定法計(jì)算效價(jià)及試驗(yàn)誤差[2]。經(jīng)生物檢定統(tǒng)計(jì)，血塞通注射液(20130303)測得效價(jià)是47.0 g·L-1，可信限率為6.91%，可信限范圍為43.8～50.3 g·L-1；血塞通注射液(12EJ07)測得效價(jià)是37.0 g·L-1，可信限率為8.79%，可信限范圍為33.6～40.1 g·L-1。兩批血塞通注射液三七總皂苷含量在標(biāo)示量的72%～98%范圍內(nèi)，與理化分析含量測定結(jié)果基本一致。

Tab 1 APTT of Xuesaitong injection at different concentrations in different production

Tab 2 Results of APTT in Xuesaitong injection or panax notoginseng

*P<0.05vsPNS

Tab 3 Results of APTT in Xuesaitong injection or ginsenoside Rb1

Tab 4 Results of APTT in Xuesetong injection, ginsenoside Rg1 or panax notoginseng

**P<0.01vsPNS

Tab 5 Results of APTT in Xuesetong injection or notoginsenoside R1

Fig 1 Correlation of APTT values between Xuesaitong injection and standard substance at different concentrations

Tab 6 Results of APTT at different concentrations of sample and

3 討論

傳統(tǒng)中藥依功效可分為解表藥、清熱藥、溫里藥、活血化瘀藥、補(bǔ)虛藥等。其中，活血化瘀藥是臨床治療心腦血管疾病最為常用藥。研究表明，活血化瘀類藥可以改善血液粘滯性，可通過抑制凝血因子活性而抑制內(nèi)外源性凝血途徑，延長凝血酶時(shí)間、凝血活酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，具有明顯抗凝血作用[3-4]。血塞通注射液就是這類藥的代表，其主要功效是活血祛瘀，通脈活絡(luò)；主要用于中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)證等。血塞通注射液現(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)通過理化檢測手段(指紋圖譜、含量測定等)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，但中藥有其特殊性和復(fù)雜性，它的活性成分不一定是有效成分。所以，有必要在現(xiàn)有的中藥質(zhì)量控制模式基礎(chǔ)上引入藥效檢測方法綜合評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量。

近些年，很多藥品檢驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥質(zhì)量控制中生物活性測定引入的重要性，并著手開展相關(guān)課題研究[4-7]，嘗試將一些成熟、可推廣的科學(xué)研究方法應(yīng)用到藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域[8-9]。已研究證實(shí)，血塞通注射液的活血化瘀作用是通過同時(shí)影響內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的抗凝血作用[10-11]。因此，選用檢測APTT指標(biāo)評(píng)價(jià)血塞通注射液活血化瘀作用的生物活性。需要說明的是，在標(biāo)準(zhǔn)品的選擇上，依據(jù)了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)理化檢測指標(biāo)中的5種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)方法的探索，以期評(píng)價(jià)兩者間的相關(guān)性和科學(xué)性。本文試驗(yàn)結(jié)果顯示，單純的人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和人參皂苷R1延長活化部分凝血活酶時(shí)間效果與血塞通注射液并沒有關(guān)聯(lián)性。說明三者不是血塞通注射液發(fā)揮延長APTT作用的有效成分；而人參皂苷Re和人參皂苷Rd由于水中溶解度小，未能檢測APTT，后兩者是否為血塞通注射液藥效有效成分還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

Fig 2 HPLC determination of Xuesaitong injectionA:Ginsenoside Re;B:Ginsenoside Rb1;C:Ginsenoside Rg1;D:Notoginsenoside R1;E:Panax notoginseng saponins;F:Xuesaitong injection

藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量反應(yīng)，檢定方法應(yīng)選用平行線測定法[2]；本文設(shè)計(jì)選擇量反應(yīng)平行線測定(3.3)法。同時(shí)，對(duì)供試品應(yīng)用法定高效液相法檢測產(chǎn)品含量，結(jié)果與生物活性檢測方法一致。中藥的有效性和活性研究注定不同于化學(xué)藥品的研究理念，單純的成分檢測遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，常常是有效成分的含量檢測結(jié)果與藥效結(jié)果不一致。從質(zhì)量控制的方向來看，該研究考察的是產(chǎn)品臨床實(shí)際應(yīng)用效果，與理化分析中成分檢測相比，更直接準(zhǔn)確體現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量。需要注意的是，生物檢測試驗(yàn)結(jié)果的精確性有別于理化試驗(yàn)，受多種因素(如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身、兔血制備過程、操作人員的熟練程度等)影響。在該研究生物活性檢測方法中，由于兔血的差異可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差，建議采用頸動(dòng)脈采血，并多只兔血重復(fù)實(shí)驗(yàn)或混合兔血后離心使用實(shí)驗(yàn)3次，減少由此帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。對(duì)照品三七總皂苷建議選擇中檢院供含量測定用的。該研究以三七總皂苷為對(duì)照品，建立血塞通注射液APTT生物活性測定方法；符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利，所得數(shù)據(jù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，且與含量測定指標(biāo)檢測結(jié)果一致。建議本品新增生物活性檢測方法結(jié)合理化分析嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量：本品依血凝儀APTT生物活性測定法[2]測定，本法的可信限率(FL%)不得大于10%，三七總皂苷在標(biāo)示量的70%～98%。

此外，三七總皂苷具有穩(wěn)定、易得、價(jià)格比較便宜等優(yōu)點(diǎn)，建議以三七總皂苷為對(duì)照品，考察活血化瘀類中藥相關(guān)生物活性測定方法，以期找到一種適合我國國情、操作簡單、成本較低的方法來控制中藥產(chǎn)品質(zhì)量。